透明顫菌血紅蛋白研究現(xiàn)狀及其在中藥中的應(yīng)用展望

1、透明顫菌血紅蛋白研究現(xiàn)狀及其在中藥中的應(yīng)用展望<    KEY WORDS  Vitreoscilla; hemoglobins; genes; transgenes氧傳遞直接或間接 影響 著需氧生物的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝。在哺乳動(dòng)物中，血紅蛋白具有氧結(jié)合特性，過(guò)去曾認(rèn)為這種氧結(jié)合蛋白只存在于哺乳動(dòng)物中，近期發(fā)現(xiàn)，它幾乎普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中1。透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin, VHb）是由透明顫菌屬（Vitreoscilla sp. C1）中產(chǎn)生的一種可溶性血紅蛋白，這種血紅蛋白能在貧氧條件下被大

2、量誘導(dǎo)合成，使透明顫菌在微氧條件下能夠很好地生存。隨著 研究 的深入，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受氧濃度調(diào)控。因此在以溶氧為限制條件的生物反應(yīng)器中，尤其是在大規(guī)模、高密度微生物發(fā)酵和動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)解決供氧 問(wèn)題 領(lǐng)域具有潛在的 應(yīng)用 前景。 1VHb的結(jié)構(gòu)及特性 透明顫菌是一種專(zhuān)性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌，屬于貝日阿托氏菌屬（Beggiatoe），在沼澤、腐爛植物等貧氧的 環(huán)境 中生長(zhǎng)旺盛。VHb在透明顫菌中被發(fā)現(xiàn)，最初被認(rèn)為是“細(xì)胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白，具有末端氧化酶的性質(zhì)2。Cyo在不同的環(huán)境條件下可呈現(xiàn)三種不同的狀態(tài)，即氧化態(tài)、還原態(tài)、氧合態(tài)，并可以相互轉(zhuǎn)化

3、；其中還原態(tài)是生理活性態(tài)，而氧合態(tài)則是富氧條件下的表現(xiàn)形式。它在577、544和420 nm處有最大吸收峰，若向溶液中鼓入CO氣體，則可形成蛋白CO復(fù)合物，在566、535及419 nm處呈現(xiàn)特征吸收峰3。但是隨著1983年真正的Cyo的分離和確定4，實(shí)驗(yàn)表明該蛋白在光譜學(xué)和氧結(jié)合動(dòng)力學(xué)性質(zhì)上與氧合肌紅、血紅蛋白相似3, 5。1986年，Wakabayashi等6結(jié)合蛋白質(zhì)初級(jí)結(jié)構(gòu)、光譜性質(zhì)、氧結(jié)合動(dòng)力學(xué)確定了該蛋白的結(jié)構(gòu)，并將該蛋白正式命名為透明顫菌血紅蛋白。VHb為同型二聚體，帶有兩個(gè)相對(duì)分子量為15 775的亞基，每個(gè)亞基含有146個(gè)氨基酸殘基和兩個(gè)b型血紅素7。完整的VHb是可溶性的，

4、但是脫去血紅素輔基便不可溶。序列 分析 表明，VHb與其它真核生物蛋白氨基酸有明顯的同源性，其中與黃羽扇豆血紅蛋白（Yellow lupin LegHb）的同源性最高，達(dá)到248。真核生物的血紅蛋白形成8個(gè)螺旋區(qū)（A、B、C、D、E、F、G和H），而VHb每個(gè)亞基形成6個(gè)螺旋區(qū)（A、B、E、F、G和H）。X射線晶體學(xué)表明VHb在近端和遠(yuǎn)端有獨(dú)特的血紅素端囊7，初步認(rèn)為受E螺旋和F螺旋的干擾所致，通過(guò)氫鍵和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四個(gè)殘基形成此結(jié)構(gòu)。大多數(shù)種類(lèi)的血紅蛋白都有一個(gè)末端的His(E7)殘基，該His殘基通常通過(guò)氫鍵與氧結(jié)合。而VHb端囊的E7位置為Gln殘基

5、。定點(diǎn)突變表明，GlnE7 His突變對(duì)VHb立體結(jié)構(gòu)影響很大，野生型VHb解離常數(shù)比GlnE7 His突變型蛋白大很多，因此，VHb與被束縛的氧親和力小，從而使氧的傳遞速度更快9, 10，這與晶體學(xué)研究結(jié)果一致。而在N端存在某些結(jié)構(gòu)差異，少了螺旋，這段序列曾被認(rèn)為可能是前導(dǎo)肽，影響VHb的分布，使活性VHb主要分布在細(xì)胞周質(zhì)11。近期用 電子 顯微鏡對(duì)VHb在透明顫菌和大腸桿菌中分布的分析結(jié)果表明，VHb主要分布在細(xì)胞質(zhì)中而不是細(xì)胞周質(zhì)，作者還認(rèn)為細(xì)胞周質(zhì)中的VHb可能是VHb過(guò)量表達(dá)而被擠出的結(jié)果12。 2VHb基因的克隆、表達(dá)與調(diào)控 20世紀(jì)80年代中期以前，學(xué)者們一直認(rèn)為，可溶性Cyo

6、在細(xì)胞呼吸中作為一種終端氧化酶而起作用。1986年，Orii等5對(duì)VHb與O2及VHb與CO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了討論，指出VHb可能是作為O2載體和儲(chǔ)存物而起作用的。1988年，Dikshit等13根據(jù)已報(bào)道的VHb氨基酸序列合成探針，與透明顫菌基因組DNA進(jìn)行雜交，在透明顫菌血紅蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb）可能位區(qū)，得到了含有vgb基因的1.4 kb的DNA片段，且此vgb基因攜帶內(nèi)啟動(dòng)子而不受載體啟動(dòng)子的控制；同年，Khosla等14也用類(lèi)似 方法 克隆了vgb基因，在vgb重組大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，同樣得出了vgb基因是以自身啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的結(jié)

7、論。他們還測(cè)定了vgb基因的核苷酸序列，結(jié)果與Wakabayashi6報(bào)道的VHb氨基酸序列十分吻合。將vgb基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，VHb的量與環(huán)境中的氧含量有關(guān)，vgb基因啟動(dòng)子在微氧條件下（小于2大氣飽和度）被誘導(dǎo)15。將vgb基因啟動(dòng)子與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和兒茶酚雙加氧酶等 報(bào)告 基因融合并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低氧條件（5）下的報(bào)告基因產(chǎn)物比高氧條件（20）下多57倍，說(shuō)明vgb基因啟動(dòng)子的活性受氧濃度的調(diào)控。當(dāng)去掉啟動(dòng)子的vgb基因和大腸桿菌tac啟動(dòng)子融合后，其表達(dá)不再受氧調(diào)控而異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)可以增加表達(dá)。vg

8、b基因在大腸桿菌和透明顫菌中表達(dá)條件相似，都隨溶氧水平下降而表達(dá)水平升高10。光譜分析表明，重組大腸桿菌表達(dá)的VHb的存在狀態(tài)與透明顫菌中表達(dá)的VHb的存在狀態(tài)相一致：在富氧條件下呈氧合態(tài)，而缺氧條件下呈現(xiàn)生理活性的還原態(tài)16。溶氧并非直接作用于vgb基因啟動(dòng)子上，而是由鐵氧還蛋白NADP還原酶（ferredoxinNADP reductase, FNR)或環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)（cyclic AMP receptor prot Ei n,CRP)相關(guān)蛋白作為轉(zhuǎn)錄激活因子正向調(diào)控vgb基因表達(dá)。其中vgb基因啟動(dòng)子區(qū)域同大腸桿菌lac啟動(dòng)子CRP結(jié)合位點(diǎn)有極高的同源性。FNR蛋白是細(xì)菌應(yīng)答厭氧環(huán)境

9、的一個(gè)調(diào)控子，屬于螺旋轉(zhuǎn)折螺旋結(jié)構(gòu)的DNA序列的結(jié)合蛋白，并且富含半胱氨酸，形成半胱氨酸口袋結(jié)構(gòu)，能與Fe2+和Fe3+參與細(xì)胞對(duì)氧的應(yīng)答。FNR調(diào)控系統(tǒng)是通過(guò)FNR蛋白在限氧條件下對(duì)厭氧基因的激活來(lái)應(yīng)答環(huán)境信號(hào)的。在缺乏fnr的大腸桿菌突變體中，vgb啟動(dòng)子在貧氧條件表達(dá)產(chǎn)物減少了一半，這表明在調(diào)節(jié)vgb啟動(dòng)子活性中存在著FNR或FNR樣蛋白質(zhì)17。另外Khosla等18認(rèn)為培養(yǎng)基中的氮源（例如酵母提取物）能抑制vgb啟動(dòng)子的表達(dá)，具體機(jī)制 目前 仍不清楚。 3VHb的生理功能 目前，透明顫菌血紅蛋白使細(xì)菌在低氧條件下能夠很好生存的生理功能尚不完全清楚，各國(guó) 科學(xué) 家對(duì)vgb基因進(jìn)行了細(xì)胞定

10、位、表達(dá)調(diào)控以及該血紅蛋白對(duì)能量代謝和呼吸鏈影響等多方面的研究。Kallio等提出了兩種假設(shè)：易化擴(kuò)散假說(shuō)和氧化還原效應(yīng)假說(shuō)。易化擴(kuò)散假說(shuō)認(rèn)為VHb與氧結(jié)合增加了氧在細(xì)胞周質(zhì)空間的傳遞量。Khosla和Bailey發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中表達(dá)的VHb有3545分布在周質(zhì)空間。VHb蛋白N端功能域具有弱輸送前導(dǎo)肽的功能，從而使VHb分布在細(xì)胞周質(zhì)空間和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，支持了易化擴(kuò)散假說(shuō)。氧化還原效應(yīng)假說(shuō)認(rèn)為氧合透明顫菌血紅蛋白可能影響了細(xì)胞內(nèi)一些關(guān)鍵的氧化還原敏感分子的活性，可能是呼吸鏈上的某個(gè)關(guān)鍵酶，該影響可引起能量代謝效率的提高14。吳奕等19提出了另一種假說(shuō)即末端電子受體假說(shuō)，認(rèn)為氧合態(tài)VHb作為末端電子

11、受體參與大腸桿菌呼吸鏈末端氧化過(guò)程，他們還依據(jù)這一假說(shuō)定量研究了VHb對(duì)大腸桿菌能量代謝的影響。研究表明，VHb在微氧代謝狀態(tài)時(shí)的表達(dá)大大提高了呼吸鏈末端電子受體量，促進(jìn)電子傳遞過(guò)程轉(zhuǎn)向能量代謝效率較高的Cyo途徑，從而使細(xì)胞適應(yīng)貧氧的生活環(huán)境。VHb對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用在有細(xì)胞色素o而無(wú)細(xì)胞色素d的突變體中比在有細(xì)胞色素d而無(wú)細(xì)胞色素o的突變體中更加顯著。VHb增加了這兩種末端氧化酶(尤其是細(xì)胞色素o)的含量并提高它們的活力20。低氧條件下，VHb的存在使更多的葡萄糖轉(zhuǎn)向磷酸戊糖途徑代謝，而向三羧酸循環(huán)的碳源減少，總的ATP產(chǎn)量加大，而底物水平磷酸化產(chǎn)生的ATP減少21。VHb還增加大腸桿菌吸收

12、氧的速率，但細(xì)胞中的NAD(P)H含量減小。說(shuō)明VHb提高了電子傳遞鏈的周轉(zhuǎn)率22。VHb在大腸桿菌中的表達(dá)明顯促進(jìn)了微氧條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和蛋白質(zhì)合成的能力。Khosla等23分析了VHb表達(dá)前后菌體蛋白的組成，蛋白質(zhì)的種類(lèi)沒(méi)有改變；從產(chǎn)生效應(yīng)的時(shí)間來(lái)看VHb的功能是由其本身所引起，而不是細(xì)胞在基因水平的二次應(yīng)答。盡管VHb的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，但用光譜分析方法發(fā)現(xiàn)VHb蛋白可與氧結(jié)合成穩(wěn)定的氧合態(tài)，氧合態(tài)的形成是VHb發(fā)揮生理功能的必需條件。多數(shù)證據(jù)顯示，以這種氧合態(tài)的形式介入細(xì)胞與氧的代謝途徑，最終影響某些基因的表達(dá)。 4VHb在中藥中的應(yīng)用展望 當(dāng)前，隨著人們醫(yī)療保健意識(shí)的增強(qiáng)

13、，中藥產(chǎn)業(yè)顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)我們看到，傳統(tǒng)中藥材的生產(chǎn)也面臨著一些挑戰(zhàn)，由于長(zhǎng)期盲目開(kāi)采致使生態(tài)環(huán)境遭到破壞，許多野生植物瀕臨滅絕，一些特殊生態(tài)環(huán)境下的植物引種困難，能夠引種的栽培中藥材因?yàn)楦鞣N因素影響，人工栽培藥材品質(zhì)下降等問(wèn)題使中藥材質(zhì)量產(chǎn)量得不到保障。另外，天然藥材中藥用價(jià)值高的有效成分（例如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等）含量往往很低，不能夠滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，采用化學(xué)合成的方法又會(huì)遇到工藝流程復(fù)雜、成本高、合成過(guò)程中伴隨著副產(chǎn)品及造成環(huán)境污染等問(wèn)題。隨著生物技術(shù)廣泛應(yīng)用到中藥栽培中，使這種局面得到了些許改善。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)及毛狀根培養(yǎng)技術(shù)具有人工栽培和野生采集所不具備的優(yōu)點(diǎn)：占地少，周期短，不

14、受地區(qū)和季節(jié)的限制，便于開(kāi)展大規(guī)模的生產(chǎn)；無(wú)污染，無(wú)重金屬積累，產(chǎn)物疏松，對(duì)于進(jìn)行有用成分的生產(chǎn)和提取尤其便利。利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性成分較為常用，20世紀(jì)70年代日本利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)人參皂苷，現(xiàn)已采用大容量發(fā)酵罐，產(chǎn)出的皂苷組分及藥理活性與親本植物基本相同，皂苷含量為親本植株的3倍以上24。利用毛狀根培養(yǎng)進(jìn)行活性成分生產(chǎn)，增殖速度快，合成能力強(qiáng)，產(chǎn)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后遺傳性能較穩(wěn)定，并利于進(jìn)行高產(chǎn)株系選擇，如用黃芪毛狀根生產(chǎn)黃芪甲苷等25。據(jù)不完全 統(tǒng)計(jì) ，藥用植物毛狀根培養(yǎng)已在26個(gè)科100多種植物中獲得成功。目前，植物細(xì)胞和毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)所采用的發(fā)酵罐多為微生物發(fā)酵所采用的平葉式生物反應(yīng)系統(tǒng)或氣

15、升式生物反應(yīng)器。但由于植物細(xì)胞本身所具有的一些特殊性，如細(xì)胞容易聚集、細(xì)胞分化、細(xì)胞的脆弱性、代謝途徑和代謝產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的復(fù)雜性，使得植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)難以達(dá)到最佳效果。植物細(xì)胞及毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)存在著的制約因素限制了植物細(xì)胞次生代謝物合成能力的提高，甚至某些時(shí)候合成能力喪失?？梢?jiàn)選擇理想的生物反應(yīng)器對(duì)植物細(xì)胞和毛狀根大量培養(yǎng)很重要，需要考慮主要影響因素，如氧傳輸、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合性能和剪切力強(qiáng)度。增強(qiáng)反應(yīng)器的混合性能，如增加通氣和轉(zhuǎn)速可以促進(jìn)物質(zhì)在反應(yīng)器內(nèi)傳輸，但較強(qiáng)的剪切力會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生傷害。因此反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和改進(jìn)應(yīng)綜合考慮這幾方面的因素，力求反應(yīng)器的混合性能良好的同時(shí)，使系統(tǒng)的剪

16、切環(huán)境降低。但是 機(jī)械 方面的改進(jìn)往往成本高且達(dá)不到理想的效果，而VHb蛋白使專(zhuān)性好氧菌透明顫菌在限氧條件下生存得很好，為中藥材細(xì)胞和毛狀根培養(yǎng)解決供氧不足問(wèn)題提供了一條新途徑。由于vgb基因調(diào)控機(jī)制在專(zhuān)性和兼性耗氧菌中十分保守，它在多種微生物中都獲得了表達(dá)，如假單胞桿菌、鏈霉菌、霉菌、歐文氏菌等。VHb在大腸桿菌中應(yīng)用最早，也比較成熟。將vgb基因克隆到含淀粉酶的基因工程大腸桿菌，VHb的表達(dá)提高細(xì)胞密度，使酶產(chǎn)量提高數(shù)倍26。1999年，Nilsson等27得到了淀粉酶更高的含vgb基因的菌株 。vgb基因不僅能在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，在其他菌種中也有很好的表現(xiàn)。VHb在鏈霉菌中的表達(dá)可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)28；VHb還能有效提高頭孢菌素C在霉菌中的產(chǎn)量29。Patel等30在假單孢桿菌（Burkholderia sp.）中的研究也證實(shí)了vgb基因的表達(dá)對(duì)蛋白產(chǎn)量起正向作用。文瑩等31將vgb基因轉(zhuǎn)入阿維鏈