透視尤文贅瘤細(xì)胞總RNA修飾的樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定-外科

1、透視尤文贅瘤細(xì)胞總RNA修飾的樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定-外科        作者摘要：王劍，桑宏勛，王臻，郭征 【 樹突細(xì)胞；贅瘤,Ewing；總RNA；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；癌癥疫苗    【AbstractAIM摘要: To investigate RNA expression of dendritic cells(DC) pulsed with totol RNA from Ewing sarcoma cells. METHODS摘要: DC was generate

2、d from the peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of Ewing sarcoma patients. Su*ce markers of matured DCs was detected by flow cytometer(FCM). Total RNA was isolated from Ewing sarcoma by Trizol. DC were transfected with total tumor cell RNA. The expression of DC tansfected with total RNA was meas

3、ured by RTPCR method. RESULTS摘要: Su*ce markers of DC pulsed with total RNA changed apparently. CD40 increased from 32.24% to 72.32%. CD83 increased from 17.39% to 30.97%, while monocyte CD14 declined from 26.37% to 10.46% .This indicated the significant reinforcement of antigen presentation of DC. R

4、TPCR showed the specific sequence EWSFLI1 of Ewing sarcoma can be combined with the primer specifically at the best temperature of 54. CONCLUSION摘要: DC pulsed with total RNA of Ewing sarcoma cells can present tumor specific antigen and express its characteristic sequence EWSFLI1 specifically. &

5、#160;  【Keywordsdendritic cells; sarcoma, Ewings; total RNA; reverse transcriptase polymerase chain reaction; cancer vaccines    【摘要目的摘要： 探索樹突狀細(xì)胞（DC)經(jīng)尤文贅瘤細(xì)胞總RNA加載后的體外RNA表達(dá)情況. 方法摘要： 采用分離尤文贅瘤患者外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)DC,用流式細(xì)胞儀檢測DC成熟后的表面標(biāo)志，Trizol法提取患者尤文贅瘤組織總RNA,用總RNA轉(zhuǎn)染DC，用RTPCR方法檢測腫瘤總R

6、NA加載的DC的表達(dá). 結(jié)果摘要： 經(jīng)尤文贅瘤總RNA加載的DC表面標(biāo)記發(fā)生明顯變化，DC的特異性表面標(biāo)志如CD40由32.24%增高至72.32%,CD83由17.39%增高至30.97%,而代表單核細(xì)胞的CD14則由26.37%下降至10.46%，標(biāo)志其抗原呈遞功能明顯增強(qiáng). RTPCR測定顯示尤文贅瘤中的特異性序列EWSFLI1可以和引物特異性結(jié)合，并且最佳結(jié)合溫度為54. 結(jié)論摘要： 尤文贅瘤細(xì)胞總轉(zhuǎn)染的DC可以呈遞腫瘤特異性抗原，并特異性的表達(dá)其特有序列EWSFLI1.    【樹突細(xì)胞；贅瘤，Ewing；總RNA；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；癌癥疫苗

7、    0引言    細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocytes, CTL)能夠介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答,引導(dǎo)特異性腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng). CTL的特異性免疫應(yīng)答依靠于腫瘤抗原的存在,腫瘤抗原被抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)識別吞噬后,在抗原遞呈細(xì)胞內(nèi)加工處理形成特定的多肽片斷,和MHC類分子完全匹配后遞呈到細(xì)胞表面,被相應(yīng)細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)識別,形成腫瘤抗原多肽MHCTCR復(fù)合物,在協(xié)同刺激因子的共同功能下,激活特異性細(xì)胞毒性淋

8、巴細(xì)胞,產(chǎn)生免疫反應(yīng)、清除腫瘤細(xì)胞1. 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC)是體內(nèi)最重要的專職抗原遞呈細(xì)胞2,可由骨髓干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞及外周血單個核細(xì)胞在細(xì)胞因子功能下誘導(dǎo)擴(kuò)增. 95%的尤文贅瘤家族具有特異的染色體異位,從而形成的EWSFLI1融合基因是尤文贅瘤家族發(fā)生、進(jìn)展的主要原因3. 本探究從尤文贅瘤患者外周血中分離單個核細(xì)胞在IL4和GMCSF誘導(dǎo)下分化擴(kuò)增DC,從患者尤文贅瘤組織中提取腫瘤總RNA加載DC,并對經(jīng)總RNA加載后的DC進(jìn)行鑒定，確定經(jīng)腫瘤RNA加載的DC持續(xù)表達(dá)相應(yīng)特異性腫瘤抗原,為DC在尤文贅瘤生物學(xué)免疫治療中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 

9、   1材料和方法    1.1材料RPMI1640 (美國GIBCO公司,14.1 g/包)；胎牛血清（杭州四季青,250 mL/瓶）；IL4（美國RD 公司,lot#AG131091,14.45×105 U/5 ug/mL stock）；rhGMCSF（海南通用同盟藥業(yè)有限公司,150 ug/支）；Trizol(美國GIBCO公司)；OligodT(美國GIBCO公司)；血細(xì)胞分離機(jī) (瑞典GAMBRO.BCT)；梯度PCR儀(德國Eppendorff公司)；流 式 細(xì) 胞 儀(美國Beckman Coulte

10、r公司)；尤文贅瘤瘤體標(biāo)本由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科2005年收治患者自愿提供（已簽知情同意書）； PCR引物由北京三博生物技術(shù)公司合成正向序列為5CCACTAGTTACCCACCCCAAACTG3，反向序列為3GTGATACAGCTGGCGTTGGCG5.    1.2.1尤文贅瘤細(xì)胞總RNA提取手術(shù)無菌切除活力好的尤文贅瘤組織，將其均勻切成1 mm3大小的組織塊，研磨后加Trizol 2 mL消化2 h,將消化好的細(xì)胞裂解液吸進(jìn)2 mL裝的離心管中，加氯仿0.2 mL，靜止2 min，然后進(jìn)行離心，離心設(shè)定為摘要： 8160 g, 4, 15 min

11、, 取上清無色水相0.8 mL，裝進(jìn)新的2 mL裝的離心管中，加0.5 mL異丙醇，靜置10 min，然后再次離心，離心設(shè)定為摘要：8160 g, 4，10 min, 觀察總RNA為管底的白色沉淀，用DEPC水溶RNA，并測RNA濃度為4 g/L.    1.2.2DC的體外培養(yǎng)利用血細(xì)胞分離機(jī)（分離管道摘要：往除白細(xì)胞裝置管路；分離程序摘要： MNC程序）采集尤文贅瘤患者外周血中的單個核細(xì)胞. 將獲得的單核細(xì)胞移進(jìn)6孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，密度為摘要: 1×108/孔,培養(yǎng)液為摘要： RPMI1640(10 g/L L谷氨酰胺, 10 g/L

12、非必須氨基酸,10 g/L 丙酮酸鈉,100 mL/L 胎牛血清)，37, 50 mL/L CO2孵箱貼壁2 h,后用PBS洗滌液洗往未貼壁的細(xì)胞（大部分為小的淋巴細(xì)胞），然后加新鮮培養(yǎng)液摘要：RPMI1640IL4(800 U/mL)GMCSF(800 U/mL)，37,50 mL/L CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 d，第2日和4日更換新鮮培養(yǎng)液摘要：RPMI1640IL4(800 U/mL)GMCSF(800 U/mL).    1.2.3總RNA加載DC在DC培養(yǎng)的第5日，在實(shí)驗(yàn)組中以10 mg/L的比例加進(jìn)總RNA ,放進(jìn)孵箱中培養(yǎng)過夜. 在DC培養(yǎng)的

13、第6日，在對照組中不加進(jìn)總RNA進(jìn)行加載.    1.2.4DC的成熟誘導(dǎo)預(yù)先在兩個100 mm Petri培養(yǎng)皿中分別接種5×107的單個核細(xì)胞，2 h后吸棄其中的非黏附細(xì)胞,37, 50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清即為成熟DC條件培養(yǎng)液 (preparation of monocyte conditioned medium, MCM)，在實(shí)驗(yàn)組中加進(jìn)MCM，放進(jìn)孵箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，在對照組中部分加進(jìn)MCM，部分則不加MCM.    1.2.5.1培養(yǎng)前后DC表面標(biāo)記的測定收集實(shí)驗(yàn)組和

14、對照組兩組細(xì)胞各分成5小組，每小組再分成6等份，用PBS調(diào)成5×105/10 L，加進(jìn)FITC標(biāo)記的mAb(CD14, CD40, CD83, CD86, HLA DR),4避光染色1 h,續(xù)加二抗，4避光染色1 h，洗滌后用10 mL/L多聚甲醛固定,流式細(xì)胞儀分析.    1.2.5.2總RNA加載DC的RTPCR測定 RTPCR檢測分為3組摘要： 取3個PCR小管，設(shè)為a, b, c，各加進(jìn)2 L OLigo dT,然后在3個小管中分別加進(jìn)2 L . a摘要: 經(jīng)腫瘤總RNA加載的DC總RNA; b摘要: 未經(jīng)腫瘤總RNA加載的DC總RN

15、A; c摘要: 腫瘤組織的總RNA. 緊接著3管均補(bǔ)水至11 L，70, 5 min，快速進(jìn)冰中5 min，室溫離心8160 g. 繼續(xù)在3管中各加進(jìn)5×buffer 5 L, dNTP(10 mm/mL) 2.5 L, AMV RT (10 u/n) 1.5 L,DEPC水 5 L. 使總體系達(dá)到25 L ，然后將3個小管置于42 1 h，即成cDNA. 將以上三種cDNA置于梯度PCR儀上進(jìn)行PCR檢測，設(shè)定摘要： 退火溫度94，解鏈溫度摘要：56.5,延伸溫度摘要： 72. 共35個循環(huán) . 最后對RTPCR產(chǎn)物再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳.   

16、0;統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS8.0統(tǒng)計(jì)軟件采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果    2.1培養(yǎng)前后DC表面標(biāo)記流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示加載了總RNA的DC和不加載總RNA的DC表面標(biāo)志有差別. DC的特異性表面標(biāo)志如CD40, CD83在加載了總RN后表達(dá)增高，HLADR,共刺激分子CD86表達(dá)也增高,而代表單核細(xì)胞的CD14表達(dá)則下調(diào)(P<0.05，表1).    表1總RNA轉(zhuǎn)染DC后對DC表面標(biāo)

17、記的影響（n=6, %, x±s）    細(xì)胞表面標(biāo)記加載總RNA, DC未加載總RNA, DCCD1410.46±7.52a26.37±6.63CD4072.32±13.48a32.24±10.96CD8687.69±7.56a31.35±9.11CD8330.97±6.57a17.39±5.22HLADR93.62±4.83a67.65±2.36aP<0.05 vs未加載總RNA, DC.    

18、2.2外周血單核細(xì)胞來源成熟DC的形態(tài)在顛倒光學(xué)顯微鏡下，單核細(xì)胞培養(yǎng)至7 d時，大部分懸浮生長，可見較多細(xì)胞胞體變大且外形不規(guī)則,細(xì)胞膜呈“樹枝狀”突起，胞質(zhì)豐富，具有典型DC形態(tài)(圖1).    圖1成熟DC形態(tài)×40    2.3總RNA加載DC的RTPCR測定尤文贅瘤中的特異性序列EWSFLI1可以和引物特異性結(jié)合，并且最佳結(jié)合溫度為54（圖2）. 經(jīng)腫瘤總RNA 加載后的DC和腫瘤細(xì)胞一樣可以和引物特異性結(jié)合的序列，而未經(jīng)腫瘤總RNA加載的DC則無顯示，經(jīng)尤文贅瘤總RNA加載的DC可以特異性表達(dá)

19、尤文贅瘤的特異性序列EWSFLI 1 (圖3).     3討論    尤文贅瘤家族是一種原發(fā)性的神經(jīng)外胚層腫瘤,包括起源于骨及軟組織的尤文贅瘤、胸壁的Askin瘤及骨軟組織外周的原發(fā)性的神經(jīng)外胚層腫瘤4. 95%的尤文贅瘤家族具有特異的染色體異位t(11;22)(q24;q12),從而形成的EWSFLI1融合基因是尤文贅瘤家族發(fā)生、進(jìn)展的主要原因,也是尤文贅瘤家族診斷、治療及預(yù)后的標(biāo)志物5-6.    DC是專職抗原呈遞細(xì)胞，其獨(dú)特功能表現(xiàn)在識別和吞噬病原體，將大分子抗原加

20、工成肽段，刺激未致敏T細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答. 本探究將尤文贅瘤總RNA作為腫瘤抗原加載在DC上，以激發(fā)CTL產(chǎn)生抗腫瘤免疫. 由于95%的尤文贅瘤家族均含有特定的EWSFLI1融合基因，因此用含EWSFLI1融合基因的總RNA 往誘導(dǎo)抗腫瘤免疫具有極好的靶向性.    應(yīng)用尤文贅瘤具有特異的EWSFLI1融合基因，可以表達(dá)特異性的抗原的特征，我們將尤文贅瘤的總RNA加載DC, 以誘導(dǎo)抗原特異性CTL. 為了給出其靶向性治療的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，我們用RTPCR法往檢測EWSFLI1mRNA的表達(dá). 在以往的類似試驗(yàn)中，多采用抗原肽脈沖DC，要求對患者的HLA表型

21、，抗原肽的抗原表位有清楚的熟悉，不能進(jìn)行很好的靶向性治療. 我們利用總RNA沖擊DC可以包含多種腫瘤抗原的編碼信息,包括尚未識別的腫瘤抗原,使腫瘤細(xì)胞逃避免疫反應(yīng)的可能性減小,能誘導(dǎo)廣泛的免疫反應(yīng)7，我們將尤文贅瘤總RNA加載DC,表達(dá)EWSFLI1融合基因特異性抗原，并應(yīng)用RTPCR方法證實(shí)了加載的確定性，為成熟DC實(shí)驗(yàn)如加載后的DC誘導(dǎo)激活CTL反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).【參考文獻(xiàn)    1 李用國，梁增偉，蔡大川. 樹突狀細(xì)胞體外激活的CTL殺傷效應(yīng)J. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,7(2)摘要:203-205.    2 Ike H, Shimada H, Yamaguchi S, et al. Outcome of total pelvic exenteration for primary rectal cance J. Dis Colon Rectum, 2003,46(4)摘要:474-479.    3 郭衛(wèi)，童春容. 惡性腫瘤的免疫治療進(jìn)展J. 中華骨科雜志，2000,23(S1)摘要:51-54.    4 West .