RPV6在人參二醇組皂苷(PDS)減輕LPS休克腦損傷中表達的變化及意義

1、RPV6在人參二醇組皂苷(PDS)減輕LPS休克腦損傷中表達的變化及意義    【摘要】     目的 通過觀察人參二醇組皂苷(PDS)對TRPV6蛋白的影響，探討PDS對LPS誘導(dǎo)休克時腦損傷的保護機制。方法 將大鼠隨機分為對照組、LPS休克(LPS)組、地塞米松(LPS+Dex)組、PDS低劑量(LPS+PDSL)組、PDS中劑量(LPS+PDSM)組及PDS大劑量(LPS+PDSH)組。大鼠靜脈注射LPS(4 mg/kg)4 h后，觀察各組大鼠生存期，計算生存率，Western Blot檢測大腦皮質(zhì)

2、中TRPV6和Bcl2的蛋白表達。結(jié)果 與對照組相比，LPS組大鼠生存率降低達50%，腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達水平明顯降低，Bcl2/Bax蛋白表達的比值降低;而與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS各組大鼠生存率增加，腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達水平明顯增高，Bcl2/Bax比值也增高。 結(jié)論 PDS減輕LPS誘導(dǎo)的腦損傷，可能與上調(diào)腦皮質(zhì)中TRPV6蛋白有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  脂多糖(LPS)，人參二醇組皂苷(PDS)，TRPV6，Bcl2，Bax    Protective ef

3、fect of panaxadiols against brain injury induced by LPS through upregulating TRPV6WANG Hao, ZHONG JiaTeng, LIU Ning, et al.The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To explore the protective effect of panaxadiols (PDS) on brain injury induced by lipop

4、olysaccharides (LPS) and its mechanism. Methods Rats were divided into control, LPS, LPS + dexamethasone (DEX) and LPS + PDS low, middle and high dose groups randomly. Survival rate of rats in every group was calculated. The expressions of TRPV and BCL2 were detected by Western blot. Results Compare

5、d with control group, survival rate of LPS group was decreased, the expression of TRPV6 and BCL2/BAX protein ratio were decreased. Compared with LPS group, survival rates of LPS+DEX group and LPS+PDS groups were increased，and the expressions of TRPV6 protein and BCL2/BAX protein ratios were also upr

6、egulated in LPS+Dex group and all LPS+PDS groups. Conclusions The effect of PDS against brain injury induced by LPS may be related with upregulating TRPV6 protein.【Key words】 Lipopolysaccharides (LPS); Panaxadiols (PDS); TRPV6; BCL2; BAX 內(nèi)毒素(endotoxin) 存在于革蘭陰性細菌(G-)細胞壁外膜中,其主要生物活性成分為脂多糖(lipopolysacch

7、aride,LPS),在內(nèi)毒素休克的發(fā)病機制中具有十分重要的作用。已有研究表明，神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子與顱腦損傷之間有密切關(guān)系1;鈣穩(wěn)態(tài)在細胞凋亡中起重要作用2。鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白(Ca2+ transport protein，CaT1/TRPV6)1999年從人的小腸中克隆，屬于TRPV家族，是細胞膜上調(diào)控細胞外鈣離子內(nèi)流的主要鈣通道之一3，TRPV6的活性與細胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)4。已有研究表明人參二醇組皂苷(PDS)能減輕LPS休克腦損傷5。本研究的目的是通過復(fù)制LPS休克大鼠模型，觀察TRPV6在PDS減輕LPS誘導(dǎo)的腦損傷時的作用，進一步探討LPS對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可能作用機制。1 材料與方

8、法1.1 實驗動物分組 健康Wistar大鼠(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物室提供)48只，體重(250±10)g，雌雄不限，隨機分為6組(每組8只)：對照組、LPS休克(LPS)組、地塞米松(LPS+Dex)組、PDS低劑量(LPS+PDSL)組、PDS中劑量(LPS+PDSM)組、PDS高劑量(LPS+PDSH)組。實驗方法參照文獻5進行。1.2 腦皮質(zhì)蛋白的提取 稱取100 mg腦皮質(zhì)，加入1 ml組織蛋白提取液，用電動勻漿器冰浴上充分勻漿。2 000 r/min，4離心20 min，棄沉淀，取上清。12 000 r/min，4離心10 min，上清即為總蛋白。BioRad法測定蛋

9、白含量。1.3 Western印跡檢測TRPV6、Bcl2和Bax蛋白的表達 各組取蛋白25 g 與5×上樣緩沖液250 mmol/L TrisHCl(pH6.8)，10%SDS，0.5%溴芬藍，50%甘油，5%巰基乙醇混合，100變性5 min，進行SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移到PVDF轉(zhuǎn)移膜上。PVDF膜經(jīng)漂洗、封閉后各加入稀釋度為1200 的兔抗TRPV6、Bcl2和Bax多克隆抗體，4，過夜。然后各加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，稀釋度為1500，室溫孵育2 h 。經(jīng)PBST洗滌，DAB顯色。用凝膠成像系統(tǒng)對各條帶的吸光度值進行定量分析。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 結(jié)果

10、以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,各組之間各項檢測指標比較采用t檢驗。2 結(jié) 果2.1 4 h存活率 觀察各組大鼠生存期并計算生存率，LPS組4 h存活率是對照組的50%(P<0.05)，LPS+Dex組是對照組的80%(P<0.05)。2.2 PDS對LPS休克腦皮質(zhì)中TRPV6 蛋白變化的影響 與對照組相比，LPS組腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達水平明顯降低，而與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組腦皮質(zhì)中TRPV6的蛋白表達水平明顯增高，其中LPS+PDSM組明顯增高，如圖1。1.對照組;2.LPS組;3.LPS+DEX組;4.LPS+

11、PDSL組;5.LPS+PDSM組;6.LPS+PDSH組，下圖同圖1 各組大腦皮質(zhì)TRPV6的蛋白表達2.3 PDS對LPS休克腦皮質(zhì)中BCL2,BAX蛋白表達的影響 Western印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組腦皮質(zhì)中Bcl2/Bax的比值下降;與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組腦皮質(zhì)中，Bcl2/Bax的比值升高，其中LPS+PDS中劑量組的Bcl2/Bax比值明顯增加，如圖2。圖2 各組腦皮質(zhì)Bcl2/Bax的蛋白表達3 討 論鈣離子(Ca2+)在細胞的生命活動中具有重要作用，所有類型細胞的各種功能均不同程度地被鈣離子調(diào)控。細胞內(nèi)鈣離子濃度處于嚴格的調(diào)節(jié)控制之中，

12、以維持細胞的重要生理功能。但這種巨大的鈣離子濃度梯度也使細胞處于一種永恒的危險境地，易于受到許多因素的作用，從而影響鈣信號調(diào)控作用，導(dǎo)致細胞功能異常，嚴重時可誘導(dǎo)細胞損傷或凋亡6，7。目前的研究結(jié)果表明，細胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定似乎起著更為重要的作用，不管是升高還是降低，打破這種穩(wěn)態(tài)就可能導(dǎo)致細胞凋亡，而細胞膜鈣離子通道對維持細胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定起著十分重要的作用8。研究發(fā)現(xiàn)Bcl2還有調(diào)節(jié)線粒體的功能，它能抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì),如細胞色素C(CytC)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)。胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Bcl2蛋白控制Ca2+離子流,影響胞內(nèi)Ca2+重新分布,人們發(fā)現(xiàn)凋亡與Ca2+流從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入

13、胞質(zhì)有關(guān),且Bcl2能阻斷這種鈣流9;Bax通過作用于線粒體而誘導(dǎo)細胞凋亡的Bax分布于線粒體外膜上,引起線粒體膜通透性改變及MPT孔開放,可允許相對低分子量的物質(zhì)，包括Ca2+自由通過線粒體膜,引起細胞凋亡10。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，大鼠單獨注射LPS 4 h后，生存率降低，TRPV6蛋白表達明顯降低，這提示，大腦皮質(zhì)TRPV6蛋白表達水平的降低，進而影響胞內(nèi)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)，而且Bcl2/Bax蛋白表達水平的比值明顯降低，不能抑制鈣內(nèi)流，導(dǎo)致細胞凋亡。與LPS組相比，LPS+Dex組和LPS+PDS組TRPV6明顯升高，而且Bcl2/Bax蛋白表達水平的比值明顯增高，有抑制細胞內(nèi)鈣內(nèi)流

14、的可能，穩(wěn)定細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而抑制凋亡，這些與大鼠生存率增高有關(guān)。以上結(jié)果表明，LPS+PDS組和LPS+Dex組TRPV6蛋白的表達均明顯高于LPS組，這可能與PDS及地塞米松對內(nèi)毒素休克腦組織的具有一定的保護作用有關(guān)。    【參考文獻】  1 薛 文,李守緘.創(chuàng)傷性腦損傷后鈣超載機制的研究進展J.臨床醫(yī)藥實踐雜志 2008;17(5):3214.2 張 瑜,常 明,韓 威,等.鈣激活蛋白酶與蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細胞凋亡的機制J.中國老年學(xué)雜志，2008;28(1):268.3 Bdding M，F(xiàn)lockerzi V.Ca2+Depen

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