RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定12 種植物油中的3 種甾醇含量

1、RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定12種植物油中的3種甾醇含量王夢(mèng)麗, 馮亞男, 謝紅英, 陳芙蓉, 孫嘉茵, 李宇茜, 徐小平（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041）摘要: 采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC 建立同時(shí)測(cè)定植物油中菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇含量的方法。采用C8柱(250 mm×4.6 mm×5 m 為色譜柱, 流動(dòng)相A 相為乙腈,B 相為水, 通過梯度洗脫方式, 以流量為1mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm 對(duì)植物油中菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇進(jìn)行分離檢測(cè)。 結(jié)果表明, 菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇的質(zhì)量濃度范圍分別為5.12101.4,5.0

2、8101.6,5.09101.8 g/mL 時(shí),3 個(gè)甾醇的線性關(guān)系良好( 線性方程分別為y =3699x -5454, y =4951x +8889, y =3994x -3800; 相關(guān)系數(shù)r 2分別為0.9989,0.999 9,0.999 4, 檢測(cè)限為2.5g/mL, 平均回收率分別為99.79%100.6%,98.17%99.80%以及97.76%102.24%,進(jìn)樣精密度( n =6分別為2.29%,1.66%,2.12%,重復(fù)性RSD 分別為2.49%,1.78%,2.72%,穩(wěn)定性RSD 分別為1.95%,2.56%,2.40%。通過對(duì)12種植物油中3種甾醇含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,

3、 表明相對(duì)于氣相色譜法(GC, 采用HPLC 法具有更穩(wěn)定、 更準(zhǔn)確、 更簡(jiǎn)便等特點(diǎn), 是同時(shí)檢測(cè)植物油中菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇的較好方法。 關(guān)鍵詞: 植物油；菜油甾醇；豆甾醇；- 谷甾醇；反相高效液相色譜文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào): 1674-5124( 2016 04-0060-05Determination of three sterols in vegetable oils by RP-HPLCWANG Mengli ，F(xiàn)ENG Ya nan ，XIE Hongying ，CHEN Furong ，SUN Jiayin ，LI Yuqian ，XU Xiaoping（West C

4、hina School of Pharmacy ，Sichuan University ，Chengdu 610041，China ）Abstract:A RP-HPLC method is established to determine the contents of campesterol ，stigmasterol It indicates a good linear relationship （linear equations ：y =3699x -5454，y =4951x +8889and 994x -3800；correlation coefficients ：0.9989，0

5、.9999and 0.9994）. The limit of detection is g/mL; the recovery of the three components is 99.79%-100.6%，98.17%-99.80%and 97.76%-102.24%respectively. Sampling precision （n =6）is 2.29%，1.66%and 2.12%；repeatability RSD is 2.49%，1.78%and 2.72%; and stability is 1.95%，2.56%and 2.40%.Compared to gas chrom

6、atography ，HPLC method is more accurate ，more stable and much simpler. It is a better method to determine campesterol ，stigmasterol and -sitosterol in vegetable oil. Keywords:vegetable oil ；campesterol ；stigmasterol ；-sitosterol ；RP-HPLC收稿日期: 2015-11-10; 收到修改稿日期: 2015-12-27作者簡(jiǎn)介: 王夢(mèng)麗（1991-），女，湖北松滋市人，

7、碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。通訊作者: 徐小平（1962-），男，四川宜賓市人，副教授，碩士，主要從事藥物質(zhì)量控制研究。中國(guó)測(cè)試0引言植物甾醇是一類植物活性成分, 具有調(diào)節(jié)免疫、 降低血脂和膽固醇、 抗腫瘤、 抗氧化以及護(hù)膚等功能。 Sriraman 等1研究發(fā)現(xiàn), 竹葉中的植物甾醇具有很大的雌激素活性。 Cynthia T.Srigley 等2測(cè)定了市場(chǎng)上一些食品以及食品添加劑中5種主要植物甾醇的含量, 從而為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA 對(duì)于植物甾醇治療冠心病的療效提供了數(shù)據(jù)支持。 目前研究已鑒定出200多種植物甾醇3, 包括- 谷甾醇、 豆甾醇、 菜油甾醇、 菜籽甾醇等; 其中

8、- 谷甾醇、 豆甾醇和菜油甾醇是植物中含量最多的甾醇4。 總之, 植物甾醇具有十分獨(dú)特的生理活性, 在醫(yī)藥5、 化妝、 食品6等行業(yè)中應(yīng)用廣泛。植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的三萜類化合物, 多數(shù)甾醇雙鍵在C-5位上, 而在C-3位存在羥基, 且羥基是其主要的活性基團(tuán)7。 由于甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似, 而且部分以甾醇酯( 脂肪酸酯和酚酸酯 的形式存在8, 因此需要對(duì)甾醇樣品進(jìn)行特殊處理且配合適合的檢測(cè)方法, 才能對(duì)甾醇含量進(jìn)行完整的分析測(cè)定。目前, 植物甾醇分析的主要流程通常是脂質(zhì)分離, 加堿皂化, 甾醇衍生化9等。 在前處理方法中, 最早使用溶劑結(jié)晶10、 超聲波輔助萃取、 皂化等方法,

9、 隨著科技的發(fā)展, 超臨界流體萃取11、 分子蒸餾法12等新興手段也逐漸運(yùn)用到了甾醇的提取中。 對(duì)于甾醇的檢測(cè)方法來說, 運(yùn)用薄層色譜法、 氣相色譜法以及高效液相色譜法對(duì)甾醇的研究取得了重大進(jìn)展。 薄層色譜法由于操作繁瑣, 顯色后不穩(wěn)定, 仍難以滿足現(xiàn)代分析的要求。 氣相色譜法雖分辨率高, 熱穩(wěn)定性好13, 但需要進(jìn)行衍生化, 同時(shí)操作溫度較高, 測(cè)量過程中可能會(huì)破壞樣品分子結(jié)構(gòu)9, 因此對(duì)于甾醇的測(cè)量會(huì)產(chǎn)生一定影響。 而高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便, 結(jié)果可靠, 穩(wěn)定性好, 能夠與不同的檢測(cè)器聯(lián)用從而對(duì)不同物質(zhì)中的植物甾醇進(jìn)行分析14, 且不需要對(duì)甾醇進(jìn)行衍生化即可直接進(jìn)樣。本文首次采用反相高效液

10、相色譜法對(duì)常見的12種植物油中菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇含量進(jìn)行了測(cè)定, 以期對(duì)植物油中植物甾醇的研究提供參考。1實(shí)驗(yàn)部分儀器與試藥LC-2010A 高效液相色譜儀( 日本島津公司; CPA225D 型電子天平( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司;B-220 型恒溫水浴鍋( 上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;KL10260D 型超聲波清洗機(jī);TGL-16G1 對(duì)照品溶液。 分別稱取菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇對(duì)照品適量于10mL 容量瓶中, 加甲醇至刻度, 搖勻, 于4 下冷藏備用。色譜柱:Agilent C8(250 mm×4.6 mm×5 m; 流動(dòng)相:A 相為乙腈,B

11、相為水, 采用梯度洗脫,0 120min 75%85%A 相,120160 min 85%A 相; 流量:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm; 柱溫:35 ; 進(jìn)樣量:20 L。 在上述條件下, 對(duì)照品以及樣品色譜圖見圖1。 結(jié)果表明, 此條件下菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇的分離度均大于1.5, 拖尾因子均在1.0左右, 達(dá)到了定量分析的要求, 故該方法可用于上述3種成分的含量測(cè)定。2方法與結(jié)果分別取菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇對(duì)照品溶液, 重復(fù)進(jìn)樣, 記錄峰面積, 計(jì)算RSD 值。 結(jié)果表明王夢(mèng)麗等:RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定12種植物油中的3種甾醇含量61中國(guó)測(cè)試2016年4月

12、編號(hào)樣品總甾醇/( mg · g -1 菜油甾醇/( mg · g -1 豆甾醇/( mg · g -1( mg · g -12火麻籽油1.8980.604±2.1 0.552±3.2 0.742±2.3 3亞麻籽油1.5210.824±1.7 0.315±2.1 0.382±1.8 4清脈油0.783±2.7 5山茶籽油1.169-1.169±2.6 6沙棘油1.047-1.047±2.5 7月見草油0.9140.182±1.5 0.292±2

13、.5 0.440±3.4 8葡萄籽油0.9080.137±3.4 0.150±1.3 0.621±1.6 90.346±3.1 11紫蘇油0.455-0.202±2.8 0.253±1.9 表412種植物油中3種植物甾醇的含量( n =3Y =4951X +88890.9999線性范圍/( g · mL -15.08101.6檢出限/( g · mL -1菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇峰面積RSD 值分別為稱取杏仁油適量, 按照1.2項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行處理, 按照1.3項(xiàng)下的色譜條件, 分別于0,2,

14、4, 6,8,12 h 進(jìn)樣, 記錄峰面積, 計(jì)算RSD 值。 結(jié)果顯示供試品中菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇峰面積的RSD 值分別為1.95%,2.56%,2.40%,表明供試品溶液在12h 內(nèi)穩(wěn)定。取杏仁油適量, 精密稱定, 加2.0mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液稀釋, 制成9份均分為3組, 分別加入3個(gè)不同水平的菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇對(duì)照品混合液, 按照1.2項(xiàng)下供試品制備方法進(jìn)行處理, 1.3項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定, 記錄色譜圖, 計(jì)算得加樣回收率, 如表3所示。樣品測(cè)定以1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 測(cè)得12種植物油中3種植物甾醇含量結(jié)果如表4所示, 色譜圖見圖2。待測(cè)物方法的平

15、均加樣回收率( n =3時(shí)間/min1. 菜油甾醇;2. 豆甾醇;3.- 谷甾醇。A. 植物甾醇對(duì)照品;B. 樣品加標(biāo);C. 樣品。圖1植物甾醇對(duì)照品、 樣品及樣品加標(biāo)色譜圖第42卷第4期 時(shí)間/min圖212種植物油樣品色譜圖3討論由于植物中的部分甾醇以甾醇酯的形式存在, 要進(jìn)行色譜檢測(cè)必須先水解成游離甾醇。 同時(shí), 由于植物甾醇存在于復(fù)雜的植物基質(zhì)中, 許多不皂化物如游離脂肪酸、 甘油酸酯、 膠質(zhì)以及蠟質(zhì)等都會(huì)對(duì)植物甾醇的分離檢測(cè)產(chǎn)生影響15; 因此, 有必要將樣品經(jīng)過一定的處理后再進(jìn)行測(cè)定。 本實(shí)驗(yàn)在甾醇提取過程中, 確定皂化條件為100 皂化30min。 菜油甾醇和豆甾醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常

16、接近, 豆甾醇僅在支鏈上比菜油甾醇多出了一個(gè)甲基, 分子量相差12, 是分離中的難點(diǎn)。 在等度洗脫下, 不同的流動(dòng)相皆不能有效分離菜油甾醇和豆甾醇, 同時(shí)也不能分離谷甾醇與附近的雜質(zhì)。 采用梯度洗脫,3 種植物甾醇得到了有效分離, 分離度達(dá)1.5以上, 滿足含量測(cè)定要求。由表4可知,12 種植物油中均含有- 谷甾醇, 但3種甾醇含量分布各有不同。 其中, 小麥胚芽油中無論是總甾醇量還是- 谷甾醇量和菜油甾醇量皆最高, 總甾醇量是其他油甾醇量的5倍。 甾醇含量最少的為青刺果油, 僅含有少量的- 谷甾醇。 同時(shí), 豆甾醇在12種植物油中含量普遍不高, 而沙棘油、 山茶籽油以及青刺果油中僅含有- 谷

17、甾醇, 山茶籽油中- 谷甾醇含量較多達(dá)到1.169mg/g。值得注意的是, 清脈油即多種油組成的混合油, 其總甾醇量排在表中的第4位, 達(dá)到1.35mg/g,菜油甾醇和谷甾醇均排在第4位, 豆甾醇排在第5位, 表現(xiàn)出混合后的清脈油在甾醇的分布上具有較好的均衡性和高品質(zhì)性。 由于- 谷甾醇具有抗氧化、 抗感染、 免疫調(diào)制、 退熱以及抗腫瘤的作用, 對(duì)血糖的控制能起到很好的作用16, 豆甾醇對(duì)于肝癌細(xì)胞也有一定的控制作用17; 因此, 以菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇為測(cè)量指標(biāo)來對(duì)植物油進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)是十分可行的。4結(jié)束語綜上, 本文建立了高效液相色譜法對(duì)植物油中的菜油甾醇、 豆甾醇和- 谷甾醇的同

18、時(shí)定量方法, 具有操作簡(jiǎn)便、 靈敏度較高、 專屬性較強(qiáng)和準(zhǔn)確度較高等特點(diǎn)。 能夠較好地展現(xiàn)出12種常見植物油中3種甾醇的分布規(guī)律, 顯示出不同植物油中甾醇含量不同, 進(jìn)而說明食用植物油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的差異性。 本方法可為植物油的質(zhì)量控制提供甾醇指標(biāo)的參考, 對(duì)提高食品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有現(xiàn)實(shí)意義。參考文獻(xiàn)1SRIRAMAN S, RAMANUJAM G M, RAMASAMY M K,et al. Mohankumar.Identification of beta -sitosterol and stigmasterol in Bambusa bambos (L. Voss leaf extract usi

19、ng HPLC and its estrogenic effect in vitroJ.Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2015 (115: 55-61. 2SRIGLEY C T, HAILE E A. Quantification of plantsterols/stanolsin foods and dietary supplements containing addedphytosterolsJ.Journal of Food Composition andAnalysis,2015(40:163-176.3倪紅玉, 溫

20、超, 周巖民. 植物甾醇的乳化及其應(yīng)用研究進(jìn)展J.中國(guó)油脂,2012,37(2:72-74.4MOREAU R A, WHITAKER B D, HICKS K B. Phy tosterols, phytostanols and their conjugates in foods: structural diversity,quantitative analysis and health-pro moting uses,ProgJ. Lipid Res,2002(41:457-500. 5KLINGBERG S, ELLEGARD L, JOHANSSON L, et al.Inverse

21、relation between dietary intake of naturally oc curring plant sterols and serum cholesterol in northernswedenJ.Am J Cli Nutr,2008,87(4:993-1001.王夢(mèng)麗等:RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定12種植物油中的3種甾醇含量63中國(guó)測(cè)試2016年4月4BERGWERFF A A, SCHERPENISSE P. Determinationof residues of malachite greeninaquatic animalsJ.JChromato-graphy

22、B,2003(78:351-359. 5SRIVASTAVA S, SINHA R, ROY D. Toxicological effectsof malachite green J.Aquatic Toxicology,2004,66(3: 319-329.6李寧. 孔雀石綠對(duì)健康的影響J.國(guó)外醫(yī)學(xué): 衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 2005,32(5:262-264.7李永生, 劉艷輝. 禁用藥物孔雀石綠的毒性、 危害及控制措施J.吉林水利,2010(5:100-102.8莫利, 楊迎春, 韓靜, 等. 分散液液微萃取-分光光度法測(cè)定環(huán)境水樣中孔雀石綠J.光譜實(shí)驗(yàn)室,2011,28(1:205-209.9錢

23、蓓蕾, 王媛, 蔡友瓊. 孔雀石綠快速檢測(cè)試劑盒的比較研究以及在水產(chǎn)品監(jiān)控中的應(yīng)用J.現(xiàn)代漁業(yè)信息,2011, 26(10:19-21.10葉四化, 陸超華, 謝海平, 等. 高效液相色譜雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠J.分析科學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(1:69-72.11龍朝陽, 朱炳輝, 許秀敏, 等. 高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定魚肉中孔雀石綠及隱性孔雀石綠的含量J.分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010(29:13-15.12水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定:GB/T 19857 2005S.北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005. 13水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢

24、測(cè)法:GB/T 20361 2006S.北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.14水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定液相色譜法:SC/T 3021 2004S.北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004. 15張曉紅, 呼競(jìng), 張新, 等. 高效液相色譜-庫(kù)侖電化學(xué)法在維生素E 檢測(cè)中的應(yīng)用J.哈爾濱醫(yī)藥,2010,30(3:1-3. 16胡江濤, 盛毅, 方智. 分散固相萃取-高效液相色譜法快速檢測(cè)獼猴桃中的氯吡脲J.色譜,2007,25 (3:441-442.17European Standard EN 15662. Foods of plant origin-Determination of pestici

25、de residues using GC-MS and/orLC -MS/MSfollowing acetonitrile extraction/partitioningand clean-up by dispersive SPE-QuEChERS-MethodS.European Committee for Standardization Brussels,2008.( 編輯: 徐柳6DAVID K, SHIRLEY C C. Phytosterols-heaalth benefits andpotential concerns:areviewJ.Nutrition Research,200

26、5(25:413-428. 7楊虹, 姜元榮, 魏婷婷, 等. 食用油中植物甾醇測(cè)定方法的優(yōu)化及含量分析J.中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(2:120- 124.8寇明鈺, 闞健全, 趙國(guó)華, 等. 植物甾醇來源、 提取、 分析技術(shù)及其食品開發(fā)J.糧食與油脂,2004(8:9-14. 9FENG S M, LIU S B, LUO Z S, et al. Direct saponification preparation and analysis of free and conjugated phytosterols in sugarcane (Saccharum officinarum L b

27、y reversed-phase high-performance liquid chromatographyJ.Food Chemistry,2015(181:9-14.10李萬林, 鐘姣姣, 楊憶群, 等. 植物甾醇提取及分析檢測(cè)方法研究進(jìn)展J.飲料工業(yè),2013,16(12:39-44. 11ZHAO S, LIANG H. Study of extraction of cinnamon oils from the bark ofcinnamomum cassia presl by supercritical carbon dioxideJ.Pol Chem,2006(80:99-105.12MAR