P2078 染色質(zhì)免疫沉淀檢測試劑盒說明書_ChIP Assay Kit_

1、ChIP Assay Kit 產(chǎn)品簡介:ChIP Assay Kit即Chromatin Immunoprecipitation (ChIP Assay Kit,也稱染色質(zhì)免疫沉淀檢測試劑盒或ChIP檢測試劑盒,用于通過免疫沉淀來沉淀和目標蛋白結合的染色質(zhì)片段,最后通過PCR或Southern等方法來檢測沉淀的染色質(zhì)片段的試劑盒。通常用于檢測特定的轉錄因子或組蛋白等基因組DNA結合蛋白是否和預期的特定基因組DNA序列在同一復合物中。 通過ChIP檢測可以獲得在體的(In Vivo目標蛋白和預期基因組DNA片段是否在同一復合物中的結論。EMSA,也稱gel shift獲得的結果是體外的(In V

2、itro目標蛋白和預期基因組DNA片段的結合結果,可以推斷細胞內(nèi)也發(fā)生類似的結合,但并不代表該情況在細胞內(nèi)也真實發(fā)生。而ChIP的檢測結果則可明確說明這種結合在細胞內(nèi)是真實發(fā)生的。本ChIP Assay Kit采用了Protein A+G Agarose,比Protein A Agarose或Protein G Agarose適合于免疫沉淀更多種類的抗體,包括mouse IgG1,IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs,以及human I

3、gG1, IgG2, IgG3和IgG4。本試劑盒中經(jīng)過Salmon Sperm DNA預飽和的Protein A+G Agarose和目的基因組DNA的非特異性結合大大下降。提供了預混合的對照引物(Control Primers?？捎糜跀U增human GAPDH的部分相應序列,引物序列為:5-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3;5-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3。本ChIP Assay Kit如果用于常規(guī)的染色質(zhì)免疫沉淀,共可以免疫沉淀22個樣品。 保存條件:4保存,一年有效。注意事項:請勿冷凍保存P2078-1 Protein A+G Agarose/Sal

4、mon Sperm DNA。除P2078-1外,其它溶液可以-20冷凍以保存更長時間。需自備用于ChIP的一抗,37%甲醛,PBS,PMSF,Elutioin buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3,蛋白酶K,Glycogen或tRNA,Tris平衡苯酚,氯仿,95%乙醇,70%乙醇,3M NaAc (pH5.2以及細胞刮子或細胞鏟子。PMSF(ST506 ,蛋白酶K(ST532/ST533 , Glycogen(D0812和3M NaAc pH5.2(ST351等可以向碧云天訂購。需自備超聲樣品處理儀(sonicator,也稱超聲粉碎機或超聲細胞粉碎機。使用甲醛時請在通風櫥中

5、進行操作。為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。使用說明:1.樣品超聲處理條件的優(yōu)化:A.準備適量冰浴預冷的PBS,以及100mM PMSF。將SDS Lysis Buffer適當溫浴,使其中的SDS充分溶解,并混勻。B.將細胞培養(yǎng)于10cm細胞培養(yǎng)皿中,細胞培養(yǎng)液的用量為10 ml。在預期發(fā)生目的蛋白和基因組DNA結合的時間點,直接在細胞培養(yǎng)液中加入適量甲醛,輕輕混勻,至最終濃度為1%。隨即在37孵育10分鐘,以交聯(lián)目的蛋白和相應的基因組DNA。例如,對于常規(guī)的每個10cm細胞培養(yǎng)皿中加入10 ml細胞培養(yǎng)液的情況,需加入270微升37%甲醛。請注意盡量使用高質(zhì)量的在有效使用期限

6、內(nèi)的甲醛。細胞也可以培養(yǎng)于6cm細胞培養(yǎng)皿中,相關溶液的用量需按照比例進行相應調(diào)整。C.加入1.1ml Glycine Solution (10X,輕輕混勻。室溫放置5分鐘。D.將有細胞樣品的培養(yǎng)皿置于冰浴上。吸盡含甲醛和glycine的培養(yǎng)液,盡量保持沒有液體殘留。E.在上述室溫放置5分鐘期間,用冰浴預冷的PBS稀釋100mM PMSF至1mM,即配制成冰浴預冷的含1mM PMSF的PBS。PMSF水性溶液一定要新鮮配制,其在水相中的半衰期約為30分鐘。F.加入5-10ml冰浴預冷的含1mM PMSF的PBS,洗滌細胞,吸盡液體,盡量保持沒有液體殘留。G.再加入5-10ml含冰浴預冷的1mM

7、 PMSF的PBS,進一步洗滌細胞,吸盡液體,盡量保持沒有液體殘留。H.加入1ml冰浴預冷的含1mM PMSF的PBS,用細胞刮子刮下細胞,收集至離心管中。如果細胞可以用槍吹打下來,也可以用槍吹打。對細胞進行計數(shù),分裝成每管大約100萬細胞。I.4,800-1000g離心1-2分鐘,以充分沉淀細胞。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不充分,可以適當延長離心時間。吸盡上清,盡量減少液體殘留。J.配制適量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上一步驟的100萬細胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer 重懸。K.在冰浴上孵育10分鐘,以充分裂解細胞。L.超聲處理,以剪切

8、基因組DNA,使DNA大部分斷裂成200-1000bp大小,如果能把大部分控制在400-800bp則更佳。超聲過程中請一定注意要保持樣品處于冰浴中,并且處于較低溫度。超聲剪切的效果在后續(xù)去交聯(lián)后可以用常規(guī)的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。超聲處理的條件通?？梢栽O置為10秒每次,共3-4次,功率為50W時設置為最大功率的30%,采用2mm超聲頭。不同的超聲處理儀器的設置不太一樣,摸索超聲條件時,可以先固定其他條件,先確定每次超聲多長時間不會導致明顯發(fā)熱,然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細胞用量宜固定,

9、否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實驗。M.在0.2ml經(jīng)過超聲處理的樣品中加入8微升5M NaCl,混勻。65加熱4小時,以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。N.加入等體積的Tris平衡苯酚,vortex劇烈混勻,隨后4,12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。O.加入等體積氯仿,vortex劇烈混勻,隨后4,12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。說明:上述步驟1N和1O的酚氯仿抽提可以使用DNA純化試劑盒進行操作。例如碧云天的PCR/DNA純化試劑盒(D0033。P.取少量通過酚氯仿抽提或DNA純化試劑盒獲得的液體,對于酚氯仿抽提產(chǎn)物可以取5-10微

10、升,對于DNA純化試劑盒純化產(chǎn)物可以取2-5微升,進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察超聲處理對于基因組DNA的剪切效果。2.染色質(zhì)免疫沉淀:A.在對樣品超聲處理條件進行優(yōu)化后,對于待檢測樣品按照步驟1A-1K進行操作,并參考步驟1L進行超聲處理。B.隨后對于經(jīng)過超聲處理的樣品在4,12000-14000g離心5分鐘。取上清(約0.2ml至一2ml離心管中,置于冰浴。C.配制適量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀釋經(jīng)過超聲處理的樣品,使最終體積為2毫升。D.取出20微升樣品作為Input用于后續(xù)檢

11、測。其余近2ml樣品加入70微升Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA(其中約35微升為沉淀,35微升為液體,在4緩慢轉動或擺動混勻30分鐘。此步驟的目的是減少Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特異性結合。E.4,1000g左右離心1分鐘,將上清轉移至一個新的2毫升離心管中。F.加入適量一抗,一抗的用量可以參考抗體的說明書。如果抗體的說明中未給出用于ChIP的稀釋比例,可以參考普通的免疫沉淀的稀釋比例。通常一抗的用量為0.5-1微克。4緩慢轉動或擺動混勻過夜?？梢圆患涌贵w作為陰性對照,或用無關

12、的抗體作為陰性對照,同時可以用沒有細胞樣品的溶液作為空白對照。G.加入60微升Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA(其中約30微升為沉淀,30微升為液體,在4緩慢轉動或擺動混勻60分鐘,以沉淀一抗識別的蛋白或相應的復合物。H.4,1000g左右離心1分鐘。非常小心地去除液體,切勿觸及沉淀。隨后依次用如下溶液對沉淀進行洗滌,每次洗滌液的用量為1ml,每次在4緩慢轉動或擺動洗滌3-5分鐘,隨后4,1000g左右離心1分鐘。非常小心地去除液體,切勿觸及沉淀。a.Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。b.High Salt

13、Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。c.LiCl Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。d.TE Buffer洗滌兩次。說明:完成上述所有洗滌步驟后所獲得的沉淀即可用于PCR擴增目的基因序列或用Southern檢測目的基因序列,或者用于Western檢測等。3. PCR擴增目的基因序列(如果ChIP產(chǎn)物用于檢測目的基因序列:A. 新鮮配制適量Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3。B. 完成步驟2H后,即完成所有洗滌步驟后,加入250微升Elution buffer。Vortex混勻,室溫轉動或擺動繼續(xù)洗脫3-5

14、分鐘。C. 1000g左右離心1分鐘,將上清轉移到一新的離心管中。沉淀中再加入250微升Elution buffer。Vortex混勻,室溫轉動或擺動繼續(xù)洗脫3-5分鐘。D. 1000g左右離心1分鐘,取出上清。和上一步驟,即步驟3C中獲得的上清合并。共計約500微升上清。E. 在500微升上清中加入20微升5M NaCl,混勻。65加熱4小時,以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。對于步驟2D獲得的作為Input的20微升樣品,加入1微升5M NaCl,混勻,65加熱4小時,同樣用于去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。此步驟完成后可以繼續(xù)進行后續(xù)步驟,也可以先-20凍存,第二天繼續(xù)后續(xù)步驟。說明

15、:此時的樣品已經(jīng)可以用于PCR,可以嘗試使用1、2、5或10微升樣品作為模板用于PCR檢測目的基因。此時PCR的效果和可能被沉淀下來的DNA的量,以及整個PCR擴增體系是否容易擴增目的基因有關。如果發(fā)現(xiàn)PCR效果欠佳,可以考慮通過后續(xù)的純化步驟,純化并濃縮樣品,然后再進行PCR檢測。注意:通常情況下,推薦進行后續(xù)純化后再進行PCR檢測,而Input通常不必進行后續(xù)純化步驟。F.在約520微升樣品中加入10微升0.5M EDTA,20微升1M Tris pH 6.5和1微升20mg/ml 蛋白酶K?；靹蚝?5孵育60分鐘。G.加入等體積Tris平衡苯酚,vortex劇烈混勻,隨后4,12000g

16、左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。H.加入等體積氯仿,vortex劇烈混勻,隨后4,12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。I.加入20微克glycogen或yeast tRNA,加入1/10體積的3M NaAc,pH5.2,再加入2.5倍體積無水乙醇。混勻后-70沉淀不少于1小時,或-20沉淀8小時以上。J.4,12000-14000g離心10分鐘,小心吸去大部分上清,切勿觸及沉淀。K.加入約1ml 70%乙醇洗滌沉淀。4,12000-14000g離心10分鐘,小心吸去大部分上清,切勿接觸沉淀。L.4,12000-14000g離心1分鐘,非常小心地吸除殘留液體。M.用少量T

17、E或水重懸DNA沉淀,用于目的基因的PCR檢測。用于PCR的引物最好能設計2組,可以用Input作為模板預先摸索出相應的PCR條件,并選擇一組效果較好的引物用于最終的PCR檢測。少數(shù)情況下,當PCR條帶過弱時,可以采用nested PCR技術,進行兩輪擴增。說明:步驟G至步驟M也可以采用適當?shù)腄NA純化試劑盒純化DNA,例如碧云天的PCR/DNA純化試劑盒(D0033。4.Western檢測ChIP產(chǎn)物(如果ChIP產(chǎn)物用于Western檢測:A. 接步驟2H,在完成所有的洗滌步驟后,加入25微升SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X可以用SDS-PAGE蛋

18、白上樣緩沖液(5X用水稀釋配制而成。沸水浴煮沸10分鐘。B. 可以取10-20微升用于Western檢測。使用本產(chǎn)品的文獻:1. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, Wang J, Xin J, Gang Y, Sha S, Xu B, Fan D, Nie Y, Wu K.Activating transcription factor 4 confers a multidrug resistance phenotype to gastric cancer cellsthrough transactivation of SIRT1 expression.PLoS One. 2012;7(2:e31431.2. Bao J, Li D, Wang L, Wu J, Hu Y, Wang Z, Chen Y, Cao X, Jiang C, Yan W, Xu C.MicroRNA-