HSPb1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的研究

1、    作者：時(shí)鵬王明明孫靖中馮進(jìn)波   【摘要】  目的：構(gòu)建重組人 HSPb1 真核表達(dá)載體質(zhì)粒，為研究 HSPb1 與乳腺癌發(fā)生和化療耐藥的關(guān)系做準(zhǔn)備。方法：從人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 中提取總 RNA，RT-PCR 法反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。設(shè)計(jì)引物調(diào)取目的基因片段，與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH-5，篩選菌落并抽提質(zhì)粒。測(cè)序正確后雙酶切克隆進(jìn)入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1 中，得到重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-HSPb1。用 pcDNA3.1-HSPb1 轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MA-231,RT-P

2、CR 法和 Western blot 法鑒定重組質(zhì)粒在其中的表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)酶切證實(shí)重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-HSPb1 含有目的基因 HSPb1。RT-PCR 和 Western blot 檢測(cè)表明, mRNA 和蛋白水平，轉(zhuǎn)染細(xì)胞 HSPb1 的表達(dá)均明顯增強(qiáng)。結(jié)論：pcDNA3.1-HSPb1 真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，它在乳腺癌細(xì)胞中可高表達(dá)目的基因，為進(jìn)一步研究 HSPb1 在乳腺癌發(fā)生及化療耐藥中的作用奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  乳腺腫瘤 熱休克蛋白質(zhì)類 因表達(dá) 基因重組 克隆 分子    Construction of HSPb1 expres

3、sion vector and its function in breast cancer cells     【ABSTRACT】 Objective: To construct the eukaryotic expression plasmid of recombinant human heat shock protein b1 （HSPb1） and study its expression in breast cancer cells. Methods: Total RNA was isolated from human breast cance

4、r cells MCF-7, and the full-length coding sequence of HSPb1 was constructed by standard reverse transcriptional PCR method. The fragment was inserted into the shuttle vector T. Transformation of E.coli DH-5 with recombinant plasmids and identification of bacterial colonies containing recombinant pla

5、smids by LB-agar plate containing 100g/ml of ampicillin were conducted， and recombinant plasmids were extracted and purified. All sequences amplified by PCR were confirmed by complete sequencing. Correct sequences were cloned into the pcDNA3.1 vector. pcDNA3.1-HSPb1 was transfected into breast cance

6、r cell line MDA-MB-231. The HSPb1 expression was detected by RT-PCR and Western blot. Results: Recombinant pcDNA3.1-HSPb1 contained the correct recombinant human HSPb1 sequences. Conclusions: The pcDNA3.1-HSPb1 plasmids might express the target gene in high level.    【KEY WORDS】 Breast neo

7、plasms·Heat-shock protain·Gene expression·Gene rearrangement·Cloning molecular    HSPb1是小分子量熱休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）亞家族中的重要一員。作為一種應(yīng)激蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激因素?fù)p傷、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)它還參與肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚過(guò)程，影響細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)3-6。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，HSPb1在乳腺癌和前列腺癌等腫瘤的發(fā)生、臨床預(yù)后及化療耐藥等方面均起一定的作用7

8、，8。我科已成功構(gòu)建乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1真核表達(dá)載體，這次我們用分子克隆的方法構(gòu)建了HSPb1真核表達(dá)載體，并檢測(cè)了其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究HSPb1與腫瘤的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。    1材料與方法    1.1材料pcDNA3.1真核表達(dá)載體、人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心血管病中心實(shí)驗(yàn)室保存，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所，細(xì)胞培養(yǎng)RPMI 1640和小牛血清購(gòu)于Gibco公司，所有工具酶購(gòu)自Promega 公司，亞克隆載體pMD18T Simple vector（簡(jiǎn)稱載體）、DNA片段瓊

9、脂糖凝膠回收和小量質(zhì)粒提取試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶BamH、Hind和T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine TM2000和G418購(gòu)自Invitrogen公司， HSPb1多克隆抗體和辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的兔抗羊IgG均購(gòu)自Santa cruz公司。    1.2人HSPb1基因的擴(kuò)增    1.2.1逆轉(zhuǎn)錄高水平表達(dá)HSPb1的MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)于含10 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，待90 滿后，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo dT（18T）為引物

10、，MMLV催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。    1.2.2目的基因片段的體外擴(kuò)增及回收與純化根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海博亞公司合成。上、下游引物分別為5-AAGCTTCTG AGCAGACGTCCAGAGCA-3和5-GGATCCGCATCCGGGCTAAGGCTTT-3，其中下劃線部分為酶切位點(diǎn)。95 變性5 min后，按以下參數(shù)進(jìn)行35次循環(huán)：94 變性1 min，58 復(fù)性1 min，72 延伸1.5 min。最后72 延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收并純化目的基因片段。    1.3HSPb1真核表達(dá)載體的構(gòu)建    1.3

11、.1重組亞克隆載體的構(gòu)建回收的目的基因片段16 下與載體連接2 ，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH-5，加入LB培養(yǎng)基800 l，37 搖床培養(yǎng)45 min后，取200 l涂布LA平板培養(yǎng)基，37 過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆菌株，接種至4 ml的LA培養(yǎng)基中并過(guò)夜培養(yǎng)，提取并純化質(zhì)粒。    1.3.2目的基因的序列測(cè)定測(cè)序工作由Invitrogen公司完成。    1.3.3目的基因片段克隆進(jìn)入pcDNA3.1載體測(cè)序正確的目的基因片段-載體質(zhì)粒和pcDNA3.1用BamH和Hind雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，T4連接酶連接兩片段，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感

12、受態(tài)大腸埃希菌DH-5，涂布LA平板培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)菌體。挑選菌落，提取pcDNA3.1 HSPb1質(zhì)粒。    1.4  質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選  用Lipofectamine TM2000將pcDNA3.1 HSPb1質(zhì)粒和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MDA-MB-231細(xì)胞中，G418篩選neo基因陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆分別命名為H-231和P-231。    1.5RT-PCR分析Trizol一步法提取H-231和P-231細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo dT（18T）為引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)檢

13、測(cè)引物，上游引物為5-CAAGGATGGCGTGGTGGA-3，下游引物為5-TCTCGTTGGACTGCGTGGC-3，以合成的cDNA為模板，擴(kuò)增條件為95 預(yù)變性5 min后，94 、  45 s，58 、 45 s，72 、 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 延伸7 min。取10 L PCR產(chǎn)物行2% 瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色后, Fluor Chem 9900凝膠成像系統(tǒng)觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。    1.6Western blot分析H-231和P-231細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，直接使用裂解緩沖液（2 SDS，10甘油，0.15 molL Tri

14、s-HC1）進(jìn)行裂解，然后在沸水浴中放置510 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉4 封閉過(guò)夜，棄溶液，加入5% 脫脂奶粉稀釋的抗HSPb1多克隆抗體（1:100稀釋），室溫輕搖2 h，TBST洗膜3次，加入5% 脫脂奶粉稀釋的辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的兔抗羊IgG（1:2 500稀釋），室溫輕搖2 h， TBST洗膜3次后，DAB顯色5 min，F(xiàn)luorChem 9900凝膠成像系統(tǒng)觀察分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。    2結(jié)果    2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定用Hind和BamH雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1 HSPb1,得到了

15、與預(yù)期大小相符的外源基因HSPb1插入片段。HSPb1片段為679 bp,而對(duì)照pcDNA3.1經(jīng)雙酶切后無(wú)此插入片段（圖1）,證實(shí)克隆成功。    2.2重組HSPb1全序列測(cè)序分析DNA測(cè)序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pcDNA3.1 HSPb1中插入基因大小為679 bp, 插入方向正確,所獲得的重組HSPb1與預(yù)期的DNA序列完全相同。    2.3HSPb1基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)將pcDNA3.1空載體及pcDNA3.1 HSPb1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,收集陽(yáng)性克隆細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示H-231細(xì)胞中HSPb1的mRNA表達(dá)水平明

16、顯高于P-231細(xì)胞（圖2）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染H-231細(xì)胞表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量約為27×103的HSPb1蛋白,與P-231細(xì)胞相比，HSPb1蛋白表達(dá)水平明顯提高（圖3）。    3討論    熱休克蛋白（heat shock protein， HSP） 又稱應(yīng)激蛋白（stress protein, SP）,是機(jī)體細(xì)胞在應(yīng)激原誘導(dǎo)下,高效表達(dá)的一組蛋白質(zhì)。HSP在體內(nèi)可與多種蛋白形成復(fù)合體,發(fā)揮其“分子伴侶”的作用。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，HSP家族可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和相對(duì)分子質(zhì)

17、量為30×103左右的sHSP等5個(gè)亞家族。HSPb1是sHSP亞家族中的重要一員，由205個(gè)氨基酸組成，其中第15、78和82位是絲氨酸,具有保守性，是HSPb1發(fā)生磷酸化的主要位點(diǎn)。在生理?xiàng)l件下，HSPb1主要以寡聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,應(yīng)激時(shí)HSPb1發(fā)生磷酸化，并迅速進(jìn)入細(xì)胞核和核仁內(nèi),發(fā)揮其“分子伴侶”的功能10。HSPb1的磷酸化狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)定位和寡聚化水平都影響其生物學(xué)功能。    HSPb1首先在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中發(fā)現(xiàn)，是一種雌激素受體相關(guān)蛋白，。研究發(fā)現(xiàn)HSPb1能引起乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥，在熱休克后，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA

18、-MB-231中HSPb1的表達(dá)水平升高，同時(shí)對(duì)表柔比星產(chǎn)生耐藥，但對(duì)順鉑、5-Fu、甲氨喋呤和秋水仙堿的敏感性未發(fā)生改變，。因而，對(duì)乳腺癌患者來(lái)說(shuō)，HSPb1是一個(gè)不良的預(yù)后因素。Oesterreich 等5采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了788例乳腺癌患者中HSPb1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與雌激素受體和孕激素受體的表達(dá)及染色體異倍體率正相關(guān)，與腫瘤大小和S期比例無(wú)關(guān)；HSPb1表達(dá)水平不影響乳腺癌患者的無(wú)瘤生存率和總體生存率，但在雌激素受體陽(yáng)性和需要接受放、化療的患者中，HSPb1高表達(dá)者無(wú)瘤生存期短。近年來(lái)，人們還發(fā)現(xiàn)HSPb1參與了乳腺癌的發(fā)生。ONeill等研究了HSPb1在乳腺正常上皮、

19、增生上皮和原位癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平逐漸升高，分別為7.4、25.17和61.1，HSPb1表達(dá)水平的升高在乳腺癌發(fā)生的早期就已出現(xiàn)，這可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素；而且，在乳腺良性病變及乳腺癌標(biāo)本中HSPb1與雌激素受體的表達(dá)明顯相關(guān)，說(shuō)明HSPb1的表達(dá)升高可能是激素依賴性乳腺癌發(fā)生途徑中的一個(gè)環(huán)節(jié)。 本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了pcDNA3.1 HSPb1真核表達(dá)載體。為進(jìn)一步研究HSPb1在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用及其誘導(dǎo)化療耐藥機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Lavoie JN, Hickey E, Weber LA, et al. Modulation

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