Caspase-3分光光度法試劑盒

1、凱基Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒（Caspase-3 Colorimetric Assay Kit）Cat number：KGA For Research Use Only Store at -20 for one year Expire date： 一、 試劑盒說明Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，與DNA 斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。Caspase-3在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物

2、，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒就是將caspase-3序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)。當(dāng)該底物被Caspase-3剪切后， 發(fā)色基團(tuán)即游離出來，可通過酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)（=405nm 或400nm）測(cè)定其吸光值，考察caspase-3的活化程度。 本試劑盒適用于培養(yǎng)細(xì)胞及新鮮組織caspase-3檢測(cè)。 二、 試劑盒組份組 份Cat: KGA202 （20 assays）Cat: KGA203 （50 assays）Cat: KGA204 （100 assays）儲(chǔ)存條件Lysis Buffer 5.0 mL 10.0 mL 15.0 mL 4 2×Rea

3、ction Buffer1.0 mL 2. 5 mL 5.0 mL 4Caspase-3 Substrate100L 250L 500L -200C，避光DTT50 L100 L150 L-200C三、試劑盒以外自備儀器和試劑低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)（100L的比色皿）（=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）1.5m L Microtube、PBS 、蛋白定量試劑（可選購凱基Bradford 法蛋白含量檢測(cè)試劑盒或BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒）及儀器 四、 使用注意事項(xiàng)1. Caspase-3 Substrate避光保存及使用。2 對(duì)某些凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡

4、可能存在非依賴于Caspase-3活化的機(jī)制，這種情況時(shí)利用本試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性無明顯改變，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信號(hào)通路。3 細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到35×106個(gè)或新鮮組織100mg ，以便能達(dá)到測(cè)定需要的100200g 蛋白的要求，因?yàn)镃aspase-3的活性與細(xì)胞裂解液的蛋白含量有關(guān)，如測(cè)定的OD 值偏低，可通過增加細(xì)胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。五、 操作方法（一）樣品裂解 細(xì)胞裂解方法1 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，并收集細(xì)胞；2 用PBS 洗滌細(xì)胞二次（離心2000rpm ，5min ）收集35×106個(gè)細(xì)胞，盡量去除PBS 上清；

5、 3 在收集的沉淀細(xì)胞中加入50L 冰冷Lysis Buffer（注意：使用前每50L Lysis Buffer加入0.5L DTT），吹打均勻；4 置冰上裂解2060min ，其間渦旋振蕩34次，每次10 s；或凍融23次； 5 4o C ，離心 (10,000 rpm 1 min；6 小心吸取上清（含裂解的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；7 取少量上清（12L ），常規(guī)方法（Braford 法或BCA 法）測(cè)定其中的蛋白濃度；組織裂解方法1. 每100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入50L 冰冷Lysis Buffer（注意：使用前每

6、50L Lysis Buffer加入0.5L DTT），玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次，注意低溫操作；2 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL 預(yù)冷的離心管， 10000轉(zhuǎn)/分，4離心5 min； 3小心吸取上清（含裂解的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；4取少量上清（12L ），常規(guī)方法（Braford 法或BCA 法）測(cè)定其中的蛋白濃度； （二）Caspase-3檢測(cè)1吸取50L 含50L 用Lysis Buffer補(bǔ)足至總體積50L （各組均采用同樣的蛋白量進(jìn)行測(cè)定和比較）；2. 加入50L 的2×Reaction Buffer （注意：使用前每50L 2×Reactio

7、n Buffer 加入0.5L DTT）； 3加入5L Caspase-3 Substrate并于370C 避光孵育4hr；4用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)（100L的比色皿）在=405nm或400nm 測(cè)定其吸光值。通過計(jì)算OD 誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。 注意：以Lysis Buffer和Reaction Buffer作為空白對(duì)照。（50L Lysis Buffer + 50L 2×Reaction Buffer）六、實(shí)驗(yàn)范例用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)JK 細(xì)胞凋亡，在37o C ，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h 后，按照說明書的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如下圖所示。 蛋白量（g）（S：凋亡誘導(dǎo)劑處理組， C：未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)劑處理