人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對K562細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對K562細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響          作者：林玉梅，卜麗梅，楊少娟，高申，張桂珍     【摘要】  本研究比較K562細(xì)胞與正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）黏附培養(yǎng)前后細(xì)胞增殖、化療敏感性及MDR1變化，以尋找白血病耐藥與造血微環(huán)境的關(guān)系。對懸浮培養(yǎng)和與MSC黏附培養(yǎng)的K562細(xì)胞繪制細(xì)胞生長曲線；用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期并觀察化學(xué)藥物對細(xì)胞存活率和凋亡的影響；用RT-PCR技術(shù)檢測MDR1基因表達(dá)。結(jié)果表明：與懸浮培

2、養(yǎng)比較，黏附培養(yǎng)K562細(xì)胞增殖受抑，G0/G1期細(xì)胞比例增加 (P<0.05)，S期細(xì)胞比例下降 (P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例增加(P<0.01)。在柔紅霉素（DNR）誘導(dǎo)的凋亡中，黏附培養(yǎng)組K562細(xì)胞凋亡受阻 (P<0.05)。黏附培養(yǎng)未誘導(dǎo)K562細(xì)胞MDR1基因表達(dá)，也未使K562/ADM細(xì)胞的MDR1基因表達(dá)發(fā)生改變。論文論文參考網(wǎng)結(jié)論： K562細(xì)胞與MSC黏附接觸共培養(yǎng)，可導(dǎo)致K562細(xì)胞生長抑制，并產(chǎn)生化療耐藥，其機(jī)制可能與MDR1無關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Influence of Human Mesenchymal St

3、em Cells on Cell Proliferation and Chemo-sensitivity of K562 CellsAbstract  This study was aimed to compare K562 cell proliferation，chemo-sensitivity and alteration of MDR1 before and after  adhesive culture with MSC，so as to evaluate the relationship between chemodrug-resistance of leukem

4、ia cells and hemopoietic microenvironment. K562 cell  cultivated in suspension and  adhesively cultivated with MSC were  collected respectively  and cell proliferation curves were drawn; the cell cycle was determined by  flow cytometry; the  effect of chemotherapy on ce

5、llular viability and apoptosis of K562 cell was investigated，the  MDR1 gene expression was determined  by RT-PCR.    The results showed that  K562 cells adhesively cultivated with MSC were inhibited and cells in G0/G1  increased (P<0.05)，cells in S phase decreas

6、ed (P<0.05) and those in G0/G1 increased (P<0.01)，compared with that cultivated in suspension.In process of  daunomycin-inducing   apoptosis，K562 cell apoptosis in the adhesive culture with MSC was inhibited (P<0.05).MDR1 gene expression in K562 cells  was not induced or

7、 altered by adhesive co-cultivation.It is concluded that by co-culture of cell-cell contact with MSC，growth suppression and induction of chemo-resistance of K562 cells take place.The mechanism，however，seems not relevant with MDR1.Key words  mesenchymal stem cell; K562;  drug  resistan

8、ce; apoptosis;  MDR1    耐藥是根治白血病的最主要障礙，其發(fā)生機(jī)制及逆轉(zhuǎn)的研究一直是白血病的研究熱點(diǎn)，以往人們主要集中在對單個白血病細(xì)胞本身的分子生物學(xué)改變的研究，并取得了顯著成果，但在體內(nèi)仍難克服耐藥的發(fā)生。近年來，隨著對骨髓造血微環(huán)境（hematopoietic microenviroment，HM）的認(rèn)識不斷加深，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在白血病細(xì)胞惡性克隆的增殖、分化和凋亡中起重要作用1。而骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是骨髓造血微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的主要來源，對正常造血也具

9、有調(diào)控作用，但對白血病細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究以人慢性髓細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株為靶細(xì)胞，與正常人MSC共培養(yǎng)，觀察其對K562細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響，以探討MSC與白血病耐藥的關(guān)系。材料和方法試劑柔紅霉素、阿霉素（DNR、ADM)，均購自Pharmacia公司；DMEM-LG、RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；FBS 購自Hyclone公司； RT-PCR試劑盒、蛋白酶K、RNA酶及瓊脂糖均購自Promega公司； PCR引物由上海生物工程公司合成。TRIZOL購自Invitrogen公司；Percoll(密度1.073 g/ml)，購自Amersham Bioscien

10、ces公司。碘化丙錠（PI）購自美國Coulter-Immunotech公司。人骨髓MSC的分離和培養(yǎng)骨髓MSC的分離、純化和擴(kuò)增按Pittenger等2報(bào)道的方法進(jìn)行。取肝素抗凝健康自愿者骨髓液5  ml，用Percoll分離液分離單個核細(xì)胞（MNC），以2.0×105/cm2細(xì)胞接種于75 cm2的Nunc培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)體系為含10%  FBS的DMEM-LG，置于37、5%  CO2飽和濕度的孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后換液，除去非貼壁細(xì)胞，以后每3天換液1次。待覆蓋培養(yǎng)瓶底面積的80%以上時(shí)加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，按5×1

11、03/cm2傳代培養(yǎng)，每3天換液1次。2-4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。人骨髓MSC表面標(biāo)志的鑒定將胰蛋白酶消化收獲的MSC以2×105個細(xì)胞分別與抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C和HLA-DR（PharMingen公司）室溫反應(yīng)30分鐘，經(jīng)PBS洗滌2次后與標(biāo)記FITC的二抗避光反應(yīng)15分鐘，細(xì)胞洗滌后懸浮于PBS中以備流式細(xì)胞儀分析。K562細(xì)胞與MSC黏附培養(yǎng)K562/ADM細(xì)胞株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，在ADM 1.0  g/ml的含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。試驗(yàn)前2周換用無ADM

12、的培養(yǎng)液培養(yǎng)。K562細(xì)胞株由本醫(yī)院中心研究室提供，培養(yǎng)體系同上。已傳代的MSC以1×104 /cm2接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁呈融合狀態(tài)時(shí)在其上分別直接加入對數(shù)生長期的K562和K562/ADM細(xì)胞（1×105/ml）。48小時(shí)后先去除未黏附的白血病細(xì)胞，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法3吹打收集黏附生長的白血病細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線測定懸浮培養(yǎng)組 取生長狀態(tài)良好的K562細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，含1×104細(xì)胞，每3天換液1次。黏附培養(yǎng)組 已傳代的MSC接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，含1×104細(xì)胞，待MSC完全貼壁融

13、合后，在其上直接加入懸浮生長的K562細(xì)胞1×104，體積同上。    每組均3天換液1次。在第1至8天分別收集各組K562細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每組有3個平行孔，取均值。最后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定分別取懸浮培養(yǎng)和黏附培養(yǎng)48小時(shí)的K562細(xì)胞2×106，用冷PBS洗2次，加入預(yù)冷70%乙醇固定，4過夜，RNase處理30分鐘后離心，PI染色30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。黏附培養(yǎng)對K562細(xì)胞藥物敏感性的影響MSC接種于24孔培養(yǎng)板，分2組。待細(xì)胞貼壁呈

14、融合生長狀態(tài)時(shí)，在其上直接加入懸浮生長的U937細(xì)胞，48小時(shí)后計(jì)數(shù)1組K562細(xì)胞數(shù)。另1組與相同細(xì)胞數(shù)的懸浮培養(yǎng)組平行加入含不同濃度DNR（0.1-3.2  g/ml）的培養(yǎng)液，于24小時(shí)收集白血病細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活率。每組3個平行孔，取均數(shù)。細(xì)胞凋亡的FCM檢測不同濃度的DNR作用24小時(shí)后，分別收集懸浮和黏附培養(yǎng)組K562細(xì)胞 2×106，方法同細(xì)胞周期檢測，出現(xiàn)亞G1峰的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，獲得凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均數(shù)。論文參考網(wǎng) DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測不同濃度的DNR作用24小時(shí)后，分別收集懸浮和黏附培養(yǎng)組K562細(xì)胞 2×

15、106，加細(xì)胞裂解緩沖液（1     mmol/L  tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L EDTA，pH 8.0，200 mg/L蛋白酶K，0.5% SDS），在50保溫3小時(shí)，使細(xì)胞充分裂解，酚氯仿抽提DNA，在抽提液中加1/10體積的2  mol/L  naAc和2倍體積的乙醇，使DNA沉淀，-20過夜。4、1 000×g離心，DNA沉淀用TE緩沖液溶解，加入RNA酶200 mg/L，37保溫1小時(shí)，2%瓊脂糖凝膠電泳2小時(shí)，觀察DNA ladder形成。MDR1基因表達(dá)的RT-PCR測定MDR

16、1上游引物：5-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3；下游引物：5-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3，擴(kuò)增片段157 bp。以-actin作為內(nèi)參照（擴(kuò)增片段418 bp）。用TRIZOL抽提總RNA，RT-PCR參照試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：45逆轉(zhuǎn)錄45分鐘，94  AMV RT滅活和RNA/cDNA引物變性2分鐘。循環(huán)參數(shù)：94 30秒，60 1分鐘，68 2分鐘，40個循環(huán)后68再延伸7分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0軟件分析結(jié)果，率的比較用2檢驗(yàn)，兩樣本間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。結(jié) 果MSC的生

17、長特點(diǎn)及免疫表型特征分離的骨髓單個核細(xì)胞于接種24小時(shí)時(shí)即可見大量貼壁略伸展的細(xì)胞，72小時(shí)后出現(xiàn)典型的紡錘細(xì)胞，4天左右形成克隆。MSC貼壁稀疏時(shí)，長梭形細(xì)胞的兩極朝向不規(guī)律，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞之間往往通過突起相連接。近3周時(shí)出現(xiàn)致密的細(xì)胞層，細(xì)胞兩極有規(guī)律的排列成束狀或旋渦狀。傳代后MSC生長迅速，近10天時(shí)細(xì)胞即可融合。用流式細(xì)胞儀分析了MSC的表面抗原標(biāo)記。結(jié)果顯示，MSC表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-A/B/C，而CD34、CD45、HLA-DR則呈陰性。MSC對K562細(xì)胞增殖動力學(xué)的影響K562細(xì)胞與MSC黏附培養(yǎng)8天后，從細(xì)胞生長曲線可以看出

18、，K562黏附培養(yǎng)4天時(shí)起細(xì)胞增殖與懸浮組比較受到明顯抑制 (P<0.05)（圖1）。FCM檢測懸浮與黏附培養(yǎng)后K562細(xì)胞各時(shí)相細(xì)胞的百分率如附表所示。與懸浮培養(yǎng)相比較，黏附培養(yǎng)后K562細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞增加 (P<0.05)、G2/M期細(xì)胞增加 (P<0.01)，S期細(xì)胞減少 (P<0.05)。這說明K562細(xì)胞與MSC接觸培養(yǎng)后使細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞量發(fā)生改變，增殖率下降，主要阻滯在G0/ G1期。Table.Cell cycle distribution of K562 cells cultivated in suspension and adhesively

19、 cultivated in contact with MSCs（略）化學(xué)藥物對K562細(xì)胞存活的影響 不同濃度DNR作用于懸浮培養(yǎng)組和黏附培養(yǎng)組K562細(xì)胞，在24小時(shí)時(shí)細(xì)胞的存活情況如圖2。與MSC黏附培養(yǎng)后，細(xì)胞存活率提高，在DNR濃度為0.8、1.6  g/ml時(shí)明顯降低了K562對DNR的敏感性 (P<0.05)，說明MSC誘導(dǎo)了K562細(xì)胞對DNR耐藥的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的變化DNR與K562細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)之后，用FCM檢測K562細(xì)胞凋亡率，當(dāng)DNR濃度分別為0.1、0.4、0.8  g/ml時(shí)，黏附組的平均凋亡率分別為4.0%、7.8%和14

20、.5%，而懸浮組的凋亡率分別為5.3%、11.7%和23.8%，在0.8 g/ml時(shí)凋亡率有顯著差異 (P<0.05)。分別用0.8 g/ml和1.6 g/ml DNR作用于K562細(xì)胞24小時(shí)時(shí)，DNA凝膠梯度電泳結(jié)果見圖4。懸浮培養(yǎng)組在1.6 g/ml時(shí)有DNA片段形成，并呈較明顯的凋亡DNA梯形帶。而在同等DNR濃度下，黏附組則未見DNA片段梯形帶形成。這證明與MSC黏附培養(yǎng)能抑制DNR誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。MDR1表達(dá)的影響K562和K562/ADM分別與MSC黏附培養(yǎng)對MDR1基因表達(dá)的影響見圖5。由圖5可見黏附培養(yǎng)后未誘導(dǎo)K562細(xì)胞表達(dá)MDR1，同時(shí)也未使MDR1陽性的K56

21、2/ADM表達(dá)發(fā)生改變，說明與MSC黏附培養(yǎng)對K562細(xì)胞MDR1基因表達(dá)未產(chǎn)生影響。討 論骨髓MSC可分化為成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等一組不均質(zhì)細(xì)胞組成的基質(zhì)細(xì)胞。研究證實(shí)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可通過黏附反應(yīng)來直接調(diào)控造血細(xì)胞的功能，并對造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化也起重要作用。HL-60及U937細(xì)胞株與正常成人骨髓成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞黏附培養(yǎng)后均可導(dǎo)致G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，直接抑制白血病細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞周期運(yùn)行4，5。本研究把K562細(xì)胞與正常成人骨髓MSC進(jìn)行黏附培養(yǎng)，細(xì)胞增殖受抑，K562細(xì)胞除表現(xiàn)處于G0/G1期細(xì)胞增多外，還發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞明顯減少，G2/M期細(xì)胞明顯增多，這證明MSC

22、可阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，提示MSC與白血病細(xì)胞黏附在白血病耐藥的產(chǎn)生中可能起重要作用。Konlpleva等6報(bào)道，當(dāng)HL-60和NB-4細(xì)胞系與鼠MS-5基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，Ara-C誘導(dǎo)的凋亡減弱，有人把急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由Ara-C和Vp16誘導(dǎo)的調(diào)亡降低3。除了白血病，Nefedova等7發(fā)現(xiàn)當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞系黏附于骨髓基質(zhì)細(xì)胞時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞凋亡抑制率超過50%以上。新近Tabe等8報(bào)道，骨髓MSC起源的脂肪細(xì)胞與早幼粒白血病細(xì)胞直接接觸，可降低全反式維甲酸和阿霉素誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K562細(xì)胞與MSC黏附培養(yǎng)時(shí)，對DNR的敏感性下降，在相同濃度DNR

23、作用下凋亡率下降，這證明了與MSC黏附培養(yǎng)可誘導(dǎo)K562細(xì)胞對DNR耐藥的形成。抑制細(xì)胞增殖是白血病治療的有效方法，但也是根治該病的重要障礙，因?yàn)樗辜?xì)胞對藥物不敏感，進(jìn)而促進(jìn)骨髓微小殘留?。?minimal residual disease，MRD）的產(chǎn)生。骨髓MSC和其分化的基質(zhì)細(xì)胞對白血病細(xì)胞周期的調(diào)控作用在白血病耐藥的形成中可能起重要作用。    研究發(fā)現(xiàn)，與基質(zhì)細(xì)胞黏附共培養(yǎng)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞增殖受抑、凋亡受阻的機(jī)制在不同的細(xì)胞系有所不同。 HL-60和NB-4細(xì)胞系與鼠MS-5基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，白血病細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平升高5，而41整合蛋白陽性的急性髓

24、系白血病細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附培養(yǎng)后是通過PI-3k/AKT/Bcl-2信號途徑產(chǎn)生耐藥9。這些結(jié)果說明，這種細(xì)胞間的直接黏附作用對白血病細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制是復(fù)雜的，是由細(xì)胞周期和凋亡的多重調(diào)控機(jī)制和通路完成的。同時(shí)，MSC由于能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，故還可能通過細(xì)胞因子的旁分泌作用或MSC-白血病細(xì)胞間反應(yīng)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子共同參與作用。另外，為了明確MSC與白血病細(xì)胞多藥耐藥的關(guān)系，本研究對黏附培養(yǎng)后K562和K562/ADM細(xì)胞的MDR1基因表達(dá)進(jìn)行了測定，結(jié)果表明黏附培養(yǎng)并未誘導(dǎo)K562細(xì)胞表達(dá)MDR1，也未使K562/ADM細(xì)胞MDR1表達(dá)發(fā)生改變。  

25、60; 總之，白血病細(xì)胞與骨髓MSC直接接觸對AML化療敏感性、骨髓MRD的發(fā)展和預(yù)后可能起重要影響。 【參考文獻(xiàn)】  1Gibson LF.Survival of B lineage leukemic cells ： signals from the bone marrow microenvironment. Leuk Lumphoma，2002；43：19-272Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell. Science，1999；284（5411）:143-1473Mudry RE，F(xiàn)orthey JE，York T，et al. Stromal cells regulate survi-val of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood，2000；96：1926-19324梁蓉，黃高升，陳協(xié)群等.人成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞系對HL-60細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá)的影響. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2003；11：476-4795梁蓉，黃高升，王哲等. 正常人骨髓成纖維樣基質(zhì)