兩步法從KG-1細(xì)胞株體外誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞

1、兩步法從KG-1細(xì)胞株體外誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞         11-04-01 16:02:00     編輯：studa20                 作者：余雪姣，鄭曉群，鄭昭，金晶，彭穎【摘要】  目的 ：探討兩步法從人白血病細(xì)胞株(KG-1)體外誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞(DC)的技術(shù)。方法：利用兩

2、步誘導(dǎo)法，先在培養(yǎng)體系中加入FLT3配體(Flt3-ligand)、血小板生成素(TPO)及干細(xì)胞因子(SCF) 三種細(xì)胞因子，對KG-1細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)5 d ;擴(kuò)增后的細(xì)胞在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-)的作用下誘導(dǎo)7 d，鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并用流式細(xì)胞儀分析樹突狀細(xì)胞特征性表面標(biāo)記CD40、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)情況。結(jié)果：誘導(dǎo)7 d細(xì)胞胞體較大，表面出現(xiàn)許多樹突狀突起;樹突狀細(xì)胞特征性表面標(biāo)記CD40、CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)陽性率顯著升高。結(jié)論：兩步法能促使KG-1細(xì)胞分化成具有典型形態(tài)和表

3、型特征的DC細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】  KG-1細(xì)胞;樹突狀細(xì)胞;細(xì)胞因子;誘導(dǎo)Abstract: Objective: To explore the technigue ofgeneration of dendritic cells from human leukemia cell line KG-1 after induction in vitro. Methods: Two-step inductions were carried out: At first，KG-1 cells were treated with Flt3-ligand， TPO and SCF for 5 day

4、s. Then the cells were exposed to factors including GM-CSF，IL-4 and TNF-for 7 days to acquire the properties of mature DC. In day 7，the cells morphology were observed under invert microscopy and the phenotype markets (CD40， CD80， CD86， HLA-DR)were detected with FACS. Results: After induction with cy

5、tokines，KG-1 exhibited morphologic and phenotypic properties of typical dendritic cells. Conclusion: It is possible to generate typical morphological and phenotypic DCs from KG-1 cells by two step process differentiation.Key words: leukemia cell line;dendritic cells;cytokines;differentiation樹突狀細(xì)胞(de

6、ndritic cell，DC)是體內(nèi)強(qiáng)有力的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，在免疫反應(yīng)中起了舉足輕重的作用，能誘導(dǎo)靜息T細(xì)胞，激發(fā)初級免疫反應(yīng)，在炎癥、自身免疫、移植免疫及腫瘤免疫諸多過程中起非常重要的作用1。目前，DC在人體內(nèi)雖分布廣泛但數(shù)量極少，呈高度分化狀態(tài)，體外不易長期培養(yǎng)，更難建系，這限制了人們對其生物學(xué)特性等方面的進(jìn)一步研究，因此如何獲得大量高純度DC是目前DC研究的熱點之一。Berges等2報道，人白血病細(xì)胞株(KG-1)體外經(jīng)GM-CSF、TNF-等細(xì)胞因子作用可直接誘導(dǎo)生成形態(tài)、表型和功能性DC。我們在國外研究的基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，采用兩

7、步法誘導(dǎo)，先對KG-1細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，再對擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞從樹突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)、特征性表面標(biāo)記兩方面證實為DC細(xì)胞?，F(xiàn)報告如下。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 試劑：RPMI IMDM培養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品，購于上海吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;胎牛血清(FBS)和2-巰基乙醇為GIBCO公司產(chǎn)品，購于上海普飛生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞因子均為人重組蛋白，干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、FLT3 配體(flt3-ligand，F(xiàn)L)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macroph

8、age colonystimulating factor，GM-CSF)、白細(xì)胞介素4 (interleukin 4，IL-4)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF-)為Peprotech產(chǎn)品，購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。CD80、CD86、CD40、HLA-DR單抗為ABR產(chǎn)品，購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。1.1.2 細(xì)胞：KG-1細(xì)胞，為人白血病細(xì)胞，購于上海中科院細(xì)胞庫。1.2 方法1.2.1 KG-1細(xì)胞的培養(yǎng)：KG-1細(xì)胞以1×106 cells/mL的密度接種于6孔板中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM，添加10% FBS、4 mmol/L谷氨酰氨、

9、100 U/ mL青霉素、100g/mL鏈霉素和30mol/L二巰基乙醇，于37 、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞每48小時可擴(kuò)增一倍。1.2.2 KG-1細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增：KG-1細(xì)胞以1×106 cells/mL的密度接種于6孔板中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMDM，添加10% FBS、10 ng/mL TPO+20 ng/mL SCF+25 ng/mL Flt3-ligand三種細(xì)胞因子、4 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL:青霉素、100g/mL鏈霉素和30mol/L二巰基乙醇，于37 、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)5 d。1.2.3 樹突狀細(xì)胞的誘

10、導(dǎo)：將細(xì)胞分成2份，一份作為實驗組，經(jīng)前三種細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增5 d的細(xì)胞以1×106 cells/mL的起始密度接種于6孔板中，細(xì)胞由基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM中添加5% FBS、4 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL青霉素、100g/mL鏈霉素、30mol/L二巰基乙醇、10 ng/mL GM CSF+10 ng/mL IL-4+40 ng/mL TNF-構(gòu)成的細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)，隔天換液，培養(yǎng)時間共計7 d。另一份作為對照組，以相同起始密度的細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)液不添加細(xì)胞因子，對照組同樣隔天換液，置于37 、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。1.2.4 流式細(xì)胞儀(FCM)分析免疫標(biāo)記：培養(yǎng)結(jié)束后取實驗組和對照組的細(xì)胞，經(jīng)離心(1 000次/min，5 min)后取沉淀細(xì)胞用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入FCM專用分析試管，分別加FITC標(biāo)記的小鼠抗人單抗CD80/FITC、CD86/PE、CD40/FITC、HLA-DR/PE各10L，4 孵育30 min，同時設(shè)陰性對照，PBS洗滌后標(biāo)記的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫標(biāo)記