利用ITS1和ITS4通用引物擴增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種

1、第31卷第7期熱帶作物學報利用ITS1和ITS4通用引物擴增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種曹永軍1,2，程萍2，喻國輝2*，黎永堅2，楊紫紅2，周林3華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東廣州，珠海市農(nóng)業(yè)科學研究中心，廣東珠海，華中農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，湖北武漢，摘要利用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1和ITS4，擴增采集自香蕉的13株鐮刀菌包括18SrDNA部分序列、ITS1-5.8S-ITS2全部序列和28SrDNA部分序列的片段，通過BLAST序列比對分析，確定13株菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。采用最大簡約法，以層出鐮刀菌F.proliferatum（EU151

2、490）和茄病鐮刀菌F.solani(GQ376116)為外群，將13株菌的序列與BLAST檢索獲得的尖鐮孢古巴?；?F.oxysporumf.sp.Cubense)相應序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，13株菌與NCBI登錄的4個尖鐮孢古巴?；途暌黄鸨环殖?個亞群，亞群聚類結(jié)果與回接鑒定結(jié)果及文獻報道的生理小種結(jié)果完全一致。關(guān)鍵詞香蕉枯萎病菌；rDNA-ITS；系統(tǒng)發(fā)育分析香蕉枯萎病病原菌為尖鐮孢古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubense（Foc），依據(jù)病原菌在不同香蕉品系甚至不同屬種上的為害情況將病原菌劃分為4個生理小種1-2。我國分布有1號和4號

3、2個生理小種3-4。通過致病性接種測定生理小種的傳統(tǒng)方法周期較長，受季節(jié)影響大4?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展為香蕉枯萎病菌遺傳分化與生理小種鑒定提供了更豐富、更可靠的手段5-7。大量報道表明，應用核糖體ITS（InternalTranscribedSpacer）序列設(shè)計的引物對其進行PCR擴增用于病原真菌的檢測具有較高的靈敏度8-9，也由于在真菌鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析具有快速、準確、簡便的特點而得到迅速地發(fā)展10-11。ITS1-5.8S-ITS2序列分析已經(jīng)廣泛應用于真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究中，如ITS1-5.8S-ITS2序列不僅可以構(gòu)建大豆疫霉根腐病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹,還可以分析菌株之間的遺傳進化關(guān)系1

4、2。有研究結(jié)果顯示，單純利用ITS1和ITS2序列無法區(qū)分尖鐮孢古巴專化型的生理小種13-14，本研究在致病性回接測定基礎(chǔ)上，利用鐮刀菌屬ITS1和ITS4通用引物克隆了菌株包含ITS1-5.8S-ITS2全部序列和部分18S以及28SrDNA在內(nèi)的片段，利用片段的整體信息與NCBI上登錄的相關(guān)資料開展比對研究，并利用搜索到的尖鐮孢古巴?；偷纳硇》N信息，開展了菌株的系統(tǒng)進化分析，探討利用通用引物對ITS1和ITS4克隆得到的片段整體序列信息區(qū)分生理小種的可行性。基金項目：廣東省科技廳教育部產(chǎn)學研結(jié)合項目（2007B090400083）；珠海市科技計劃項目（PC20081078，PC2008

5、2043）資助。第一作者簡介：曹永軍，男，1977年生，博士；華南農(nóng)業(yè)大學博士后流動站珠海市農(nóng)科中心研究基地在站博士后。研究方向：農(nóng)業(yè)環(huán)境科學。E-mail：alexcyj。通迅作者，喻國輝，男，1976年生，博士，高級農(nóng)藝師；研究方向：農(nóng)業(yè)微生物。通訊地址：廣東省珠海市農(nóng)業(yè)科學研究中心科研科519075;E-mail：ygh76411。收稿日期：2010-04-27修回日期：2010-07-16期曹永軍等：利用ITS1和ITS4通用引物擴增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種10991材料與方法病原菌的采集與分離鑒定菌株編號表1寄主香蕉香蕉香蕉粉蕉粉蕉香蕉香蕉供試尖孢鐮刀菌菌株采集地珠海珠海珠

6、海珠海江門湛江湛江菌株編號寄主香蕉香蕉香蕉香蕉香蕉粉蕉采集地珠海珠海珠海珠海珠海珠海2008年510月，分別于廣東珠海、江門和湛江等地采集香蕉和粉焦枯萎病病害樣本，采用常規(guī)組織分離法進行分離與鑒定15，從病株假莖病健交界處切取小塊組織，置PDA培養(yǎng)基上25培養(yǎng)23d，待長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲培養(yǎng)，產(chǎn)孢后再經(jīng)單孢分離純化后保存?zhèn)溆谩＞陙碓醇熬幪栆姳?。FOC001FOC002FOC003FOC004FOC005FOC006FOC007FOC008FOC009FOC011FOC013FOC014FOC015選45葉期的健康組培巴西蕉苗（MusaAAA）和粉蕉苗（MusaABB），采用傷根浸

7、菌液法進行接種。接種前將組培苗自苗床撥出，用自來水沖洗干凈，再分別浸在配制好的各分離菌株孢子懸浮液（1×106個/mL）中，以清水做對照，浸泡30min后移栽到盛有滅菌細砂的營養(yǎng)杯，置于溫室（2532），30d后觀察結(jié)果，每個菌株分別接種香蕉苗和粉蕉苗各30株。1.3ITS序列測定基因組DNA制備參照文獻16的方法。采用真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1（TCCGTAGGT-FocrDNA-ITS區(qū)PCR擴增與序列測定GAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），擴增ITS1-5.8S-ITS2rDNA全序列及部分18S和28SrDNA序列。引物由上

8、海英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應體系參照文獻13。反應程序為：94預變性4min，然后進入循環(huán)，94變性1min，55退火40s，72延伸90s，共35個循環(huán)，最后72延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pMD19-T載體中，陽性克隆由Invitrogen生物工程技術(shù)有限公司廣州分公司測序。系統(tǒng)發(fā)育分析13個菌株經(jīng)PCR擴增獲得的序列切去載體序列后，與利用BLAST分析程序在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫在線比對，得到已在NCBI上登錄的3個尖鐮孢古巴?；途陻?shù)據(jù)（AY864891、EU155534、EF590328），其中EF590328

9、在ATCC的登錄信息為1號生理小種，另外選擇文獻報道已知為4菌株編號表2不同菌株接種后30d的發(fā)病率接種香蕉發(fā)病率/（s）接種粉蕉發(fā)病率/（s）Neighbor-joining（Kimura2-parameter模型，bootstrap400）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。FOC001FOC002FOC003FOC004FOC005FOC015FOC006FOC007FOC008FOC009FOC011FOC013FOC014結(jié)果與分析致病性測定香蕉和粉蕉組培苗接種病原菌15d后開始顯現(xiàn)黃葉病癥，30d枯萎病癥狀明顯，并且都能從病株的病健交界處分離獲得與接種菌株相同的病原菌。部分發(fā)病輕的蕉苗葉片無黃化現(xiàn)象

10、，但縱剖球莖可見褐色至紅褐色的壞死斑點；發(fā)病重的蕉苗葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，縱剖球莖可見褐色至紅褐色的壞死，嚴重時整個球莖全部變褐色。不同菌株回接致病力的調(diào)查結(jié)果如表2所示。根據(jù)回說明：表中同列數(shù)據(jù)字母相同者，經(jīng)鄧肯氏新復極差檢驗（=0.05）差異不顯著。1100熱帶作物學報31卷接致病的能力，將菌株FOC006、FOC007、FOC008、FOC009、FOC011、FOC013和FOC014初步鑒定為香蕉枯萎病菌4號生理小種，菌株FOC004、FOC005與FOC015為1號生理小種。菌株FOC001、FOC002和FOC003未引起枯萎病癥狀，但可以從球莖組織中分離，經(jīng)大連民族學院呂國忠老師鑒

11、定為尖孢鐮刀菌。1245678910111213Mbpa10000a7000aa2.2通用引物ITS1和ITS4擴增結(jié)果以提取的所有供試真菌DNA為模板，用通用引物ITS1和ITS4擴增的rDNA-500020001000500250ITS，電泳圖譜顯示擴增出的片段大約500bp（圖1），測序后包含引物在內(nèi)的片段長度為546bp，與NCBI上登錄的尖孢鐮刀菌同類片段大小一致。aaa利用BLAST分析程序?qū)?3株真菌擴圖l通用引物擴增的供試真菌菌株ITS區(qū)PCR產(chǎn)物ITS2-部分28SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。13個供試菌與4個在NCBI上登錄相關(guān)信息，片段大小相近的尖鐮孢古巴?；途?/p>

12、株（AY864891，EU155534、EU332405和EF590328）一起被分成3個亞群。致病性回接鑒定為4號生理小種的菌圖上僅顯示bootstrap百分率大于50的數(shù)據(jù)。圖2基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析株FOC006、007、008、009、011、013、014與AY864891、EU155534和EU332405組成第1亞群，其中EU332405是文獻報道的采集自福建的4號生理小種；致病性回接鑒定為1號生理小種的菌株FOC004、005和015與美國標準菌種收藏所（ATCC）保藏的分離自澳大利亞昆士蘭的1號生理小種EF590328組成第2個亞群；第3個亞群是致病性測定時未

13、發(fā)病的菌株FOC001、002和003。3個亞群被聚為一類的支持率為100，與層出鐮刀菌（F.proliferaum）和茄病鐮刀菌（F.solani）在進化上有明顯的差異。討論ITS區(qū)受到的選擇壓力較小，進化速率較快，在絕大多數(shù)真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)28SrDNA部分序列。利用這個片段開展的BLAST比對發(fā)現(xiàn)，NCBI上登錄了大量尖孢鐮刀菌的相應序列，期曹永軍等：利用ITS1和ITS4通用引物擴增香蕉枯萎病菌核酸片段鑒定其生理小種1101發(fā)育分析，卻可以將香蕉枯萎病的生理小種準確區(qū)分，不僅將廣東省內(nèi)分離獲得的不同生理小種準確區(qū)分，還將澳大利亞分離的1號生理小種準確地聚到1號生理小

14、種亞群。有文獻13報道了2株分離自福建的香蕉枯萎病菌ITS信息的登錄號，其中EU332405登錄的是4號生理小種FOCAAA315菌株的信息，EU395428登錄的是編號為1號生理小種FOCABB361菌株的信息，但EU332405的序列長度僅為477bp，EU395428登錄的長度僅為418bp，在BLAST比對時沒有搜索到這2個序列。由于在NCBI上已經(jīng)登錄的香蕉枯萎病菌，提供生理小種信息的數(shù)量太少，為了驗證本研究生理小種鑒別的可靠性，仍然對這2個序列進行分析，由于從NCBI上下載的EU395428信息里沒有找到文獻13中列出的ITS2片段，因此在系統(tǒng)進化分析時，剔除這個提供了生理小種信息

15、但可能存在問題的序列，采納了EU332405。雖然EU332405的序列長度比其它序列少了約69bp，但系統(tǒng)進化分析的結(jié)果仍然將其分在4號生理小種的亞群。此外，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的時候還發(fā)現(xiàn)，利用這個片段的信息，不能將1號生理小種與尖孢鐮刀菌的其它寄主型區(qū)分，4號小種則可以。尤其是構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）顯示，4號生理小種亞群的個體被聚為一類的支持率比其他兩個亞群低，僅為58，說明香蕉枯萎病菌4號小種個體間在相應序列上存在較大差異，其變異頻率更快，這與王文華等14的研究結(jié)果相符。參考文獻1ZhouZ,XieL.StatusofbananadiseasesinChinaJFruits,1992,4

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22、andITS4,toAmplifySequencesforCaoYongjun1,2，ChengPing2,YuGuohui2,LiYongjian2,YangZihong2,ZhouLin31CollegeofNatureResourcesandEnvironment,SCAU,Guangzhou,Guangdong5106422ZhuhaiAgricultureResearchCenter,Zhuhai,Guangdong5190753CollegeofLifeScienceandTechnology,HZAU,Wuhan,Hubei430070AbstractThirteendifferentFusariumstrainswereisolatedfrombananainGuangdongProvince.TheirribosomalDNAi