大鼠肝卵圓樣細胞WB-F344致瘤性轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)

1、大鼠肝卵圓樣細胞WB-F344致瘤性轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化李雪飛  【摘要】： 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的細胞起源一直是許多研究者爭論的問題。而從肝癌細胞起源角度探索肝癌發(fā)生的分子機制將為進一步理解肝癌發(fā)生發(fā)展的機理提供新的證據(jù),同時也為尋找對預防、診斷和治療有價值的新的分子標記提供線索。由于卵圓細胞和多種慢性肝病的關(guān)系密切,因此認為它是肝癌的細胞來源之一。本研究應用直接致癌劑亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和過氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2

2、)聯(lián)合作用大鼠卵圓樣細胞WB-F344誘導其致瘤性轉(zhuǎn)化,并采用基因芯片技術(shù)和經(jīng)典的二維電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分別分析了卵圓細胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程不同時間點的基因表達譜和蛋白表達譜的變化,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)增殖與凋亡的失衡、mRNA代謝/轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)節(jié)、代謝的改變等生物學過程可能在卵圓細胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用,與這些生物過程相關(guān)的基因或蛋白可能是轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因子,如磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensinhomolog,pten)、周期素依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinaseinhibitor 1A,cdkn1a)、周期素依賴

3、性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 2,cdk2)、caspase-8(casp-8)、不均一核糖核酸核糖核蛋白A281(heterogeneous nuclearribonucleoprotein A2/B1 isoform,HnRPA281)、不均一核糖核酸核糖核蛋白A3(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3,HnRPA3)、不均一核糖核酸核糖核蛋白D(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D,HnRPD)、Non-POU domain-containingoctamer-b

4、inding protein(NONO)和4型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucosetransporter type 4,GLUT4)等,亦可能在肝癌的發(fā)生中起重要作用。 第一部分大鼠肝卵圓樣細胞WB-F344的致瘤性轉(zhuǎn)化和鑒定 本部分研究應用H_2O_2連續(xù)刺激(每周刺激一次,連續(xù)刺激21周)經(jīng)直接致癌劑MNNG啟動的WB-F344細胞(以下簡稱為“WB cells”),誘導其發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化。光鏡下觀察轉(zhuǎn)化細胞的形態(tài)學改變和轉(zhuǎn)化灶的形成,應用透射電鏡觀察轉(zhuǎn)化細胞超微結(jié)構(gòu)特征;應用染色體核型分析檢測轉(zhuǎn)化細胞的遺傳學改變;應用軟瓊脂克隆形成實驗分別檢測轉(zhuǎn)化細胞WB-3、WB-5、WB-7、WB-11和W

5、B-21(分別代表經(jīng)H_2O_2刺激3周、5周、7周、11周和21周的細胞)的非停泊依賴生長特性;并用MTT法檢測轉(zhuǎn)化細胞的增殖能力,用流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)測定轉(zhuǎn)化細胞的細胞周期。 結(jié)果顯示經(jīng)MNNG啟動和過氧化氫刺激的WB細胞發(fā)生了致瘤性轉(zhuǎn)化。形態(tài)學分析顯示:在過氧化氫作用后第二周,光鏡下觀察到細胞出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)化灶,排列紊亂、重疊交叉生長,喪失了接觸抑制能力。電鏡下,轉(zhuǎn)化細胞呈多邊形或立方形,與WB細胞比較含有更多的線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu),出現(xiàn)微絨毛和縫隙連接。染色體核型分析顯示轉(zhuǎn)化細胞呈異倍體核型,50%左右的細胞染色體數(shù)目異常,從27到103條不等。軟瓊脂

6、克隆形成實驗表明轉(zhuǎn)化細胞具有了非停泊性依賴生長的特性,且隨著過氧化氫作用次數(shù)的增多克隆形成能力逐漸增強。WB-3、WB-5、WB-7、WB-11和WB-21五組細胞的克隆形成率分別為0,0.1%,0.3%,0.8%和2%。正常WB細胞則不能在軟瓊脂上生長。在H_2O_2作用后的第5周(WB-5),細胞首先表現(xiàn)出軟瓊脂克隆生長,但克隆形成率較低,克隆較小;到第21周(WB-21)克隆形成能力明顯增強,克隆較大。MTT檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)化細胞的增殖能力較對照組WB細胞明顯增強(p0.000)。轉(zhuǎn)化細胞較正常的WB細胞有更多的細胞處于細胞周期的S期和G2/M期,說明轉(zhuǎn)化細胞的增殖能力旺盛。 以上這些結(jié)果

7、均提示經(jīng)MNNG啟動和過氧化氫刺激后,WB細胞發(fā)生了致瘤性轉(zhuǎn)化,為進一步分析轉(zhuǎn)化細胞的基因表達譜和蛋白表達譜的改變提供了基礎(chǔ)。 第二部分大鼠肝卵圓樣細胞WB-F344致瘤性轉(zhuǎn)化過程中的基因表達譜分析 本部分旨在分析WB細胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中不同時間點基因表達的變化,并探討差異基因的生物學意義,從中揭示可能導致WB細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的分子機制。 選取正常WB細胞(對照組)、轉(zhuǎn)化的WB-5(H_2O_2刺激5次,即作用第五周,首次出現(xiàn)軟瓊脂克隆生長)細胞和WB-21(H_2O_2刺激21次,即作用第21周,約有50%細胞染色體核型異常)細胞,分別提取細胞總RNA。應用SuperArray公司的大鼠癌通路發(fā)

8、現(xiàn)者功能芯片(rat Cancer PathwayFinder oligo microarray)比較了上述三組細胞的基因表達譜的改變。共發(fā)現(xiàn)21個基因差異表達。應用實時定量PCR技術(shù)驗證了cdkn1a、pten、casp-8和腫瘤壞死因子超家族成員b(tumor necrosisfactor receptor superfamily,member 10b,tnfrsf10b)在三組細胞中的表達,進一步證實了芯片結(jié)果的可靠性。用DAVID和GENIE ONTOLOGY數(shù)據(jù)庫對差異基因進行功能注釋,發(fā)現(xiàn)大部分差異基因產(chǎn)物都具有蛋白或核酸結(jié)合與信號轉(zhuǎn)導活性,主要參與細胞周期、凋亡、細胞粘附運動等功

9、能的調(diào)節(jié)。其中上調(diào)的基因包括cdk2、神經(jīng)細胞黏著分子1(neural cell adhesion molecule 1,ncam1)等,下調(diào)的基因包括干擾素1(interferon,beta 1,ifnb1)、干擾素1(1interferon-alpha 1,ifna1)、十八型膠原1(collagen,type,alpha 1,col18a1)等,而連續(xù)上調(diào)的基因有pten,連續(xù)下調(diào)的有cdkn1a,先上調(diào)再下調(diào)的基因有myc、fos、casp-8等。結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫分析差異基因的相互作用提示細胞增殖與凋亡的失衡可能是導致WB細胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化的部分原因,而基因cdkn1a、cdk2

10、、pten、casp-8等的改變可能與WB細胞的轉(zhuǎn)化相關(guān)。 第三部分大鼠卵圓樣細胞WB-F344致瘤性轉(zhuǎn)化過程中蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化 本部分在基因水平研究的基礎(chǔ)上,進一步從蛋白水平上探討了WB細胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中不同時間點的蛋白表達譜的改變,分析了差異蛋白的生物學意義,揭示可能在WB細胞轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用的蛋白分子。 選取正常WB細胞、轉(zhuǎn)化的WB-5和WB-21細胞,提取總蛋白。應用非線性pH3-11,長13 cm的固定pH梯度的IPG膠條和12%SDS-PAGE對它們進行2-DE分離(每組細胞各重復3次),結(jié)合蛋白考染技術(shù)獲得三組細胞的總蛋白表達譜。應用Image Master軟件對三組細胞

11、的蛋白表達譜進行差異分析。在WB細胞中平均檢測到1279±13個蛋白點、WB-5細胞中平均檢測到1141±6個蛋白點,WB-21細胞中平均檢測到1503±8個蛋白點,三組細胞的蛋白分布相似,多集中在pI 49,MV2584 KDa區(qū)域。以其中2-DE效果好、點數(shù)多的一塊膠作為參考膠,進行三組間兩兩比較匹配分析,WB、WB-5、WB-21三組細胞組間匹配的平均匹配點數(shù)分別為629±29個(WB/WB-5),752±21個(WB/WB-21)和643±31個(WB-5/WB-21),共篩選出差異大于或等于2倍的蛋白點148個。 切取了13

12、2個差異蛋白點進行MALDI-TOF-/MS/MS分析,通過數(shù)據(jù)庫搜索、比對并去冗余后,共鑒定出差異蛋白81個,其中WB和WB-5兩組細胞比較出差異蛋白29個,WB和WB-21兩組細胞比較出差異蛋白41個,WB-5和WB-21兩組細胞比較出差異蛋白27個。應用SWISSPROT()、NCBI、EBI數(shù)據(jù)庫對這些差異蛋白進行功能分類,并應用SWISSPROT和IntACT(http:/www.ebi.ac.uk/intact)數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。發(fā)現(xiàn)正常WB細胞和轉(zhuǎn)化的WB-5和WB-21細胞比較,差異蛋白主要參與代謝、氧化還原/應激反應過程。如參與代謝過程的醛脫氫酶A1(al

13、dehyde dehydrogenase,dimericNADP-preferring,ALDH3A1)、蘋果酸脫氫酶2(malate dehydrogenase 2,NAD,MDH2)等在轉(zhuǎn)化細胞中表達升高,而腺苷酸激酶1(adenylate kinase 1,AK1)、磷酸甘露糖變位酶(similar to Phosphomannomutase 2,PMM-2)則表達降低;參與應激過程的絲氨酸蛋白酶抑制劑1(serine proteinase inhibitor,clade H,member1,SERPINH 1)、熱休克蛋白8(heat shock protein 8,HSP7C)等在轉(zhuǎn)

14、化細胞表達增加,而peroxiredoxin 4(PRDX4)、PDZ and LIM結(jié)構(gòu)域1(PDZ and LIMdomain protein 1,ELFIN)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)等則表達下降。不同時間點轉(zhuǎn)化細胞的差異蛋白則主要參與轉(zhuǎn)錄翻譯/mRNA代謝調(diào)節(jié)、細胞粘附運動、氧化還原/應激反應以及細胞信號轉(zhuǎn)導。而一組RNA結(jié)合蛋白均在WB-5中表達降低,在WB-21細胞中又表達升高,包括HnRPA281、HnRPA3、HnRPD。另一個RNA結(jié)合蛋白NONO則在三組細胞表達連續(xù)升高,蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析提示NONO可能通過HnRPK與4

15、0S ribosomal protein SA(RPSA)、HSP7C、PRDX3、ATP synthase,H+transporting,mitochondrial F1complex,beta polypeptide(ATP5b)存在相互作用。而4型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucosetransporter type 4,GLUT4)則是相互作用網(wǎng)絡(luò)中的一個共同節(jié)點。這個蛋白雖然不是我們鑒定出的差異蛋白,但很多差異蛋白都與它存在關(guān)系,推測可能通過它而發(fā)生相互作用。同時,我們應用免疫印跡法鑒定了細胞角蛋白8(CK8)和RPSA在三組細胞中的表達,結(jié)果與質(zhì)譜一致。 以上這些結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄翻譯/mRNA

16、代謝調(diào)節(jié)、細胞運動粘附、氧化還原/應激反應、代謝等生物學過程可能在WB細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用。而調(diào)節(jié)mRNA代謝的一組RNA結(jié)合蛋白HnRPA281、HnRPA3、HnRPD、NONO可能在WB細胞的轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色。參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的4型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白與多種差異蛋白存在相互作用,推測可能與WB細胞的轉(zhuǎn)化相關(guān)。 結(jié)論 1.大鼠卵圓樣細胞WB-F344在MNNG和過氧化氫聯(lián)合作用下發(fā)生了致瘤性轉(zhuǎn)化。 2.建立了正常WB細胞、轉(zhuǎn)化的WB-5、WB-21細胞的總蛋白表達譜;分析了WB細胞致瘤性轉(zhuǎn)化過程中不同時間點的基因表達和蛋白表達的變化。 3.在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生改變的基因主要參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋

17、亡、細胞粘附運動等;發(fā)生變化的蛋白主要與代謝過程、轉(zhuǎn)錄翻譯/mRNA代謝、細胞粘附運動、氧化還原/應激反應等生物過程相關(guān),說明這些生物學過程可能在WB細胞的致瘤性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。 4.結(jié)合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)細胞增殖與凋亡的失衡可能是導致WB細胞發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化部分原因,其中cdk2、cdkn1a、pten、casp-8等基因可能是關(guān)鍵因子;另外,一組RNA結(jié)合蛋白HnRPA281、HnRPA3、HnRPD、HnRPA1及NONO和4型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)可能與WB細胞的轉(zhuǎn)化和肝癌的發(fā)生相關(guān)。 潛在應用價值 1.從細胞起源角度探討肝癌發(fā)生,為進一步理解肝癌發(fā)生的分子機制提供了新證據(jù)。 2.篩檢出的差異基因和差異蛋白有可能成為新的預防或診斷的分子標記,并為進一步探索肝癌治療的新靶點提供了線索。 創(chuàng)新點 1.首次建立了大鼠卵圓樣細胞WB-F344和其轉(zhuǎn)化細胞WB-5、WB-21的總蛋白表達譜。 2.從肝癌細胞起源的角度來探討肝癌的