在馬來西亞用300億OBmL小菜蛾

1、在馬來西亞用300億OB/mL小菜蛾顆粒體病毒防治小菜蛾的效果中國科學(xué)院動物研究所生物農(nóng)藥中試基地 周英杰、邢帥軍整理K. W. Pow，技術(shù)服務(wù)與發(fā)展部，馬來西亞Farmcochem Sdn. Bhd.2008年8月至10月前言小菜蛾（Plutella xylostella）是十字花科蔬菜上危害最為嚴(yán)重的害蟲，其為害造成蔬菜品質(zhì)和產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失。小菜蛾的4個齡期都能危害，主要在十字花科蔬菜葉下部取食，留下干而脆的葉上皮，受雨滴的沖擊形成孔洞。受害葉片繼續(xù)生長，孔洞合并或撕扯成片。不加選擇地應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥防治，導(dǎo)致不斷有高抗藥性的報(bào)道。這種狀況產(chǎn)生了尋求替代方法防治小菜蛾的需求。生物防治的手段已

2、經(jīng)有很多報(bào)道，其中包括使用Bt和病毒。NPV屬于桿狀病毒科，可以侵染400多種昆蟲，大部分是鱗翅目昆蟲。NPV有兩種表型，即SNPV（單粒包埋型NPV）和MNPV（多粒包埋型NPV）。有趣的是，SNPV在除鱗翅目外還有5個目的昆蟲中有報(bào)道，而MNPV只在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)。在人類已知的許多病毒中，還有一種特別的顆粒體病毒，即小菜蛾顆粒體病毒（GV），可以用來防治小菜蛾。病毒可以同其它防治手段相容，同化學(xué)農(nóng)藥相比不存在安全和/或健康的問題，持效期長，害蟲不會發(fā)展抗性，所以是非常適宜的防治手段。病毒以包含體（OB）的形式存在，在特定昆蟲中腸堿性環(huán)境下被激活，對非目標(biāo)昆蟲（如蜜蜂或者目標(biāo)害蟲的捕食性天

3、敵）等幾乎沒有影響。一旦病毒粒子進(jìn)入中腸上皮細(xì)胞，核衣殼即遷入細(xì)胞核，這種遷入可能同細(xì)胞的肌動蛋白有關(guān)。當(dāng)核衣殼接近細(xì)胞核后，其DNA脫去衣殼蛋白并進(jìn)入細(xì)胞核，的磷酸化導(dǎo)致病毒DNA解旋，表達(dá)并復(fù)制病毒基因組。這一過程與顆粒體病毒（GV）的有少許區(qū)別。GV的DNA是通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核的。對MNPV（苜蓿銀紋夜蛾NPV）來說，病毒的一些核衣殼可能繞過細(xì)胞核，直接從細(xì)胞以出芽的方式出來，這樣可以比在中腸細(xì)胞復(fù)制基因組的病毒更快地侵染其它細(xì)胞。圖1 NPV在宿主昆蟲細(xì)胞中侵染復(fù)制示意圖病毒可以侵染敏感宿主所有主要組織的細(xì)胞，其過程是開始侵染中腸上皮細(xì)胞，然后擴(kuò)散到幾乎所有其它組織，并在其中產(chǎn)生包埋型

4、病毒。最終，宿主細(xì)胞破裂，釋放出病毒包含體或者出芽型病毒，出芽型病毒再侵染其它細(xì)胞和組織。雖然第一個在美國登記的桿狀病毒殺蟲劑（商標(biāo)是Elcar，1975年）商業(yè)化失敗了，但是1984年用核型多角體病毒防治黃杉毒蛾是個著名的桿狀病毒防治害蟲成功的例子。這一事件導(dǎo)致上世紀(jì)九十年代，人們加強(qiáng)了桿狀病毒分子生物學(xué)的研究，并且重新激起了工業(yè)化開發(fā)桿狀病毒殺蟲劑的興趣。田間應(yīng)用桿狀病毒的進(jìn)展主要是在過去的二十年內(nèi)獲得的。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使大規(guī)模生產(chǎn)桿狀病毒控制害蟲的應(yīng)用成為了可能。本試驗(yàn)是為了測定一種來自中國的GV（300億OB/mL小菜蛾顆粒體病毒）在卡梅隆高地控制甘藍(lán)田里發(fā)生的小菜蛾的生物活性。方

5、法田間試驗(yàn)試驗(yàn)田屬生產(chǎn)卷心菜的農(nóng)場，位于卡梅隆高地Bertam村的大路邊，面積公頃。已經(jīng)定植40天左右，大部分植株已經(jīng)卷心。選擇該地塊是因?yàn)樾〔硕臧l(fā)生嚴(yán)重，化學(xué)農(nóng)藥不能控制其為害。小菜蛾種群已超過經(jīng)濟(jì)閾值，并且田間有大量的成蟲。卷心菜植株種植在高于地面的田圃上，沒有遮光，行間距是40cm×45cm。每個試驗(yàn)小區(qū)有25株卷心菜。試驗(yàn)一共有100株，設(shè)置2個處理2個重復(fù)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。在每塊試驗(yàn)地內(nèi)，所有的卷心菜按下述的處理列表處理，同時另外調(diào)查15株卷心菜作為處理間的隔離。除非下大雨，施藥和調(diào)查將每周都進(jìn)行。處理列表UTC未處理的對照GV9升水中加18毫升藥劑（PxGV），處理大約12

6、0株卷心菜。試驗(yàn)藥劑是一種GV，每毫升產(chǎn)品含有300億OB。用量相當(dāng)于每公頃用900毫升產(chǎn)品，噴水量是450升（稀釋500倍）。用背負(fù)式噴霧器噴灑藥液，配備3/64空心圓錐噴嘴。藥液直接噴灑在初展的第5-8片葉片的背部和菜頭的頂部。噴藥的日期分別是2008年8月4、12、15、24日，調(diào)查分別在2008年8月的3、5、12、15日進(jìn)行。調(diào)查記錄4個齡期中每個齡期的個體數(shù)，以及植株上所有的活蟲數(shù)。室內(nèi)試驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)是為了研究GV侵染小菜蛾幼蟲后癥狀的發(fā)展及其致病性。沒有用化學(xué)農(nóng)藥處理的新鮮葉片采自上述卷心菜田。葉片洗凈，用下述方法處理，風(fēng)干后接入小菜蛾幼蟲。用手提式噴壺（mister）將藥液噴灑到

7、葉片上。UTC未處理對照（水）GV每升含有0.5毫升NPV（300億OB/毫升 PxGV，2000倍）從未處理田塊共采18頭幼蟲，一組是1齡、3齡、4齡各3頭，用GV處理的卷心菜葉喂養(yǎng)，另一組同樣的9頭試蟲用未處理卷心菜葉喂養(yǎng)。帶試蟲的葉子放在開口的塑料廣口瓶中，室溫12小時黑暗、12小時光照下培養(yǎng)。72小時后，所有活著的試蟲轉(zhuǎn)到未處理的葉片上，使其繼續(xù)取食。葉片每3天更換，保證試蟲的食物新鮮。如有蟲尸，即進(jìn)行檢查、除去并記錄。結(jié)果和討論室外試驗(yàn)試驗(yàn)是在2008年10月的雨季開始的。在Bertam村有中到大雨。處理前調(diào)查后（2008-8-3）第二天的早晨，進(jìn)行第一次噴灑GV試驗(yàn)（2008-8-

8、4），噴藥后3小時下了中到大雨，幾乎下了一整天。第二天（2008-8-5）進(jìn)行調(diào)查后立即重復(fù)補(bǔ)做試驗(yàn)。2008年8月3日和5日調(diào)查的結(jié)果沒有顯著差異。由于GV作用方式的原因，這一結(jié)果容易理解，與GV既不是內(nèi)吸性藥劑，也沒有觸殺作用的性質(zhì)相符合的。施藥后3小時的大雨把NPV沖刷掉了。隨后的幾天，天氣轉(zhuǎn)好，第二次噴灑GV（2008-8-5）的效果可以從9月12日的調(diào)查中看出?？傮w來說，所有數(shù)據(jù)顯示，小菜蛾幼蟲對作物的為害以及活蟲的數(shù)量同對照相比都顯著降低了。同樣，2008年8月15日和24日調(diào)查的結(jié)果表明，與對照相比，活蟲數(shù)和為害情況都顯著降低。由于卷心菜臨近收獲，試驗(yàn)的結(jié)論從最后一次調(diào)查（200

9、8-8-24）得出。試驗(yàn)結(jié)果清楚地表明，GV處理后，活蟲數(shù)下降，作物的受害減輕。用GV作的對照只有未處理對照的大約50%，可能是因?yàn)檫@個試驗(yàn)開始時，小菜蛾幼蟲數(shù)量太大，并且各齡期混合發(fā)生。這一試驗(yàn)開始時，田間有大量的成蟲和繭（蛹），這樣可能給田間提供蟲源，增加了統(tǒng)計(jì)的幼蟲數(shù)。換一種說法，對一種感染GV的特定害蟲，GV不大可能提供100%的防治。試驗(yàn)地塊沒有發(fā)現(xiàn)1齡和2齡的蟲尸，這樣死亡率的計(jì)算更傾向于推測性的。然而，3齡和4齡的蟲尸可以在GV處理的田塊中看到。蟲尸外觀黑色，一碰即破。低齡試蟲蟲體太小，其蟲尸可能被雨水打破。由于這個原因，死蟲數(shù)沒有被計(jì)入調(diào)查結(jié)果中。表1 用300億OB/mL P

10、xGV田間多次防治小菜蛾的效果（其中的數(shù)字表示平均受害的植株和15株卷心菜上不同齡期小菜蛾幼蟲的平均數(shù)）300億OB/ml小菜蛾顆粒體病毒懸浮劑多次防治小菜蛾效果工作時間對照試驗(yàn)病毒防治試驗(yàn)染蟲卷心菜數(shù)量1齡2齡3齡4齡總計(jì)染蟲卷心菜數(shù)量1齡2齡3齡4齡總計(jì)1-Sep2-SepA3-Sep129925133725T4-SepA&T無差別 5-Sep125551025105874246-Sep7-Sep8-Sep9-Sep差別 10-Sep11-SepA&T12-Sep136561330932551513-Sep14-SepA&T15-Sep123558218243413

11、16-Sep差別 17-Sep18-Sep19-Sep20-Sep21-Sep22-Sep23-SepA24-Sep11547824712341025-Sep26-Sep差別 27-Sep28-Sep29-Sep30-SepA=評價T=防治室內(nèi)試驗(yàn)室內(nèi)試驗(yàn)中，所有幼蟲放到葉片上幾分鐘即取食活躍。幾乎所有GV處理葉片上的幼蟲在開始的12到24小時內(nèi)停止取食。而未處理葉片上的幼蟲持續(xù)取食、蛻皮，并產(chǎn)生大量糞便。由于處理葉片上幼蟲停止取食，蟲體塌成扁平形狀，隨著時間推移，逐漸變褐、變黑。每次調(diào)查的蟲尸數(shù)列入下表。表2 室內(nèi)300億OB/mL PxGV防治小菜蛾的效果（數(shù)字表示當(dāng)日葉片上的死蟲數(shù)）防治

12、蟲齡12HAT24HAT48HAT3DAT5DAT7DAT10DAT14DAT對照試驗(yàn)100010000300001000400000000GV防治112-30111-401-11-與田間試驗(yàn)相對照，取食GV處理葉片的所有齡期的幼蟲死亡率都是100%。有1齡和3齡幼蟲各一頭，分別在第3天和第5天死亡。然而，其蟲尸僵硬，觸碰不化水，推測這兩個幼蟲可能死于其它不明的原因。所有GV感染的1齡幼蟲都在24小時內(nèi)死亡。身體變黑，蟲尸一碰即破。這一結(jié)果解釋了田間試驗(yàn)NPV處理后，1齡幼蟲較少，看不到其蟲尸的現(xiàn)象。1齡幼蟲可能被雨水打破并沖到地下。NPV處理的3齡幼蟲早期前部顯示壞死癥狀，并逐漸延伸到后部。這些壞死的體節(jié)外觀黑褐色。并且觸碰后蟲尸破裂并化水。有大量的液體從破裂的死亡組織中冒出。上面的照片顯示3齡幼蟲取食噴灑300億OB/mL GV的葉片被感染的情況（紅色箭頭指示取食NPV后8-12小時，蟲體前部壞死癥狀和18到24小時蟲體后部壞死癥狀）。值得注意的是，2頭4齡幼蟲試圖結(jié)繭并化蛹了。蛹體從外面清楚看見，顏色比正常蛹黑，我們及時進(jìn)行了微型解剖，以確定繭中的試蟲是否存活。這兩個蛹是死的，碰了以后化水了。致謝試驗(yàn)中使用的300億