反義caveolin1對實質腫瘤細胞中β3半乳糖基轉移酶7表達的調節(jié)作用

1、反義caveolin1對實質腫瘤細胞中3半乳糖基轉移酶7表達的調節(jié)作用         11-03-24 15:40:00     編輯：studa20           作者：秦芳， 楊玲焰， 姜智， 吳祁生， 徐嵐， 閆石， 楊世蕊， 吳士良【摘要】  目的： 研究反義caveolin1對實質腫瘤細胞中3半乳糖基轉移酶7（3GalT7）表達的調節(jié)，以期闡明cav

2、eolin1與3GalT7的相關性。方法： 運用脂質體介導轉染人工合成的caveolin1反義核苷酸（ASODN）至人類4種實質腫瘤細胞中，通過熒光顯微鏡、RTPCR及蛋白質印跡檢測3GalT7表達的變化。結果： 轉染反義caveolin1后的4種實質腫瘤細胞中3GalT7均有明顯的增強。結論： 表明caveolin1調節(jié)腫瘤細胞中3GalT7的表達，且與3GalT7的表達呈負相關。 【關鍵詞】  3半乳糖基轉移酶7； caveolin1； 反義核苷酸； 腫瘤細胞Abstract  Objective: To research the modulation of the d

3、ownregulation of caveolin1 to 3GalT7 in human parenchyma tumor cells.Methods： By means of the transfection to transfect the ASOND to four parenchyma tumor cells to detect the expression of 3GalT7. Results： The expression of 3GalT7 had been raised in the four cells after transfection of ASODN. Conclu

4、sion： Caveolin1 had a minus relationship with 3GalT7.Key words  3GalT7； caveolin1； ASODN； tumor cells多種腫瘤(如前列腺、乳腺、口腔等的腫瘤)的發(fā)生均與染色體7q31.1區(qū)內染色體缺失有關,編碼caveolin1的基因就位于7q31.1,推測caveolin1可能對正常細胞的惡性轉化和惡性增殖有抑制作用。caveolin1由Clenney等發(fā)現,相對分子質量21 00024 000,長178AA,其編碼基因定位于7q31.1,有3個外顯子。caveolin1與細胞的惡性轉化、惡性增殖、

5、侵襲、轉移以及信號傳導有關,逐漸受到人們關注。多數事實支持caveolin1是一種抑制腫瘤蛋白。用反義caveolin1致使caveolin1表達下調,并使NIH3T3細胞發(fā)生轉化，caveolin1表達顯著降低1。Wu等2研究表明，人類結腸癌細胞株和結腸癌組織中caveolin1的表達均下降,可能歸因于同時檢測到的caveolin1 mRNA水平下調。用蛋白質印跡法發(fā)現,無論在結腸黏膜還是間質,腫瘤組織的caveolinl水平都明顯低于正常。同時將caveolin1重組表達于HT29和DLD1結腸癌細胞系,并將兩種細胞注入裸鼠,觀察腫瘤形成情況,與未轉染的親代細胞相比,轉染細胞系形成的腫瘤生

6、長緩慢、體積小,甚至檢測不到。而且實驗人員將裸鼠體內形成的腫瘤細胞進行體外培養(yǎng),發(fā)現與已轉染而未注入裸鼠的親代細胞相比, caveolin1水平下降，提示caveolin1表達在細胞惡性轉化、惡性增殖的過程中下調,這可能是腫瘤發(fā)生過程中一個普遍存在的現象。國外也有研究報道反義caveolin1可使3GnT3的表達有明顯提高，而對3GnT5的作用不甚顯著。但是近年來研究發(fā)現某些腫瘤組織中caveolin1呈高表達。如何解釋caveolin1在腫瘤發(fā)生過程中這兩種完全相反的作用呢?本文通過人工合成caveolin1的反義核苷酸(ASODN)，轉染人實質性腫瘤細胞，研究caveolin1與3半乳糖基

7、轉移酶7（3GalT7）的相關性，以期為將來的深入研究打下基礎。     1  材料和方法1.1  材  料     人喉癌細胞株Hep2、人肺腺癌細胞株A549、人肝癌細胞株HepG2和人胃癌細胞株SGC7901均為本實驗室保存。小牛血清購自上海華美生物公司；RPMI1640完全培養(yǎng)基：每升RPMI1640基礎培養(yǎng)基（Gibco，美國）中，添加小牛血清100 ml，L谷氨酰胺0.292 g，NaHCO3 2.0 g，葡萄糖3.6 g，HEPES（Amresco，進口分裝 ）2 g；胰

8、蛋白酶購自Sigma公司；DEPC購自上海華舜生物工程公司；Oligo(dT)，Trizol，RNase Inhibitor，Suoercript IIRNase H Reverse transcriptase，Taq DNA聚合酶，dNTP Mix（10 mmol/L），10×PCR 緩沖液，MgCl2（25 mmol/L）購自Promega公司；瓊脂糖，Mix DNA 標準參照物購自南京大治公司；Liprofectamine 2000購自Invitrogen公司。3GalT7多克隆抗體由本實驗室制備，MMP2抗體購于Sigma公司。1.2  反義核苷酸的人工合成

9、0;    caveolinl反義核苷酸序列為5ATGTCCCTCCGAGTCTA3，經基因庫同源性檢測，未發(fā)現與人類其他基因序列有同源性，命名為CAV1。反義核苷酸序列由南京基天生物工程公司合成，全部堿基硫代磷酸型,在5端用綠色熒光蛋白FITC標記，PAGE 純化，凍干分裝， -20 保存，應用時以無菌雙蒸水溶解。以反義核苷酸打亂順序序列5ATCACCGTCGGTCTCTAT3作為陰性對照，命名為CAVD。1.3  寡核苷酸轉染細胞     將處于對數生長期的4種腫瘤細胞接種于培養(yǎng)瓶(1×106/ml)

10、,于37 5%CO2培養(yǎng)箱中溫育12 h后,按2 000介導轉染貼壁細胞的方法,將反義核苷酸和陰性對照轉染入細胞，48 h后收集。1.4  熒光成像系統(tǒng)觀測     將細胞置于熒光顯微鏡下,激發(fā)光波長為507 nm觀察。1.5  細胞收集培養(yǎng)     人喉癌細胞株Hep2，人肺腺癌細胞株A549，人肝癌細胞株HepG2，人胃癌細胞株SGC7901單層培養(yǎng)于 37 ，5 %CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，采用0.25%胰酶消化，以消化傳代后處于對數生長期的細胞備用。1.6  RTPCR 

11、;    分別收集這4種細胞株對數生長期的細胞，進行反轉錄PCR分析。以actin為內對照,分別檢測4種細胞caveolin1和3GalT7的mRNA表達水平。選用actin為內對照,以總RNA的RT產物為模板同時進行PCR擴增,PCR反應條件是94預變性4 min,94變性50 s,59退火50 s,72延伸90 s,32個循環(huán),72再延伸10 min。設計引物采用Genetyx軟件,并經基因庫Blast進行同源檢索后合成。引物由Invitrogen公司合成。     1.7  蛋白質印跡檢測腫瘤相關指標

12、0;    用蛋白質印跡(按分子克隆操作,化學顯色法顯示雜交條帶,洗片機洗片，數碼相機拍照記錄結果)檢測4種實質腫瘤細胞3GalT7表達的變化。2  結果2.1  轉染caveolin1反義核苷酸的CAV1和陰性對照CAVD后的熒光檢測      轉染caveolin1反義核苷酸的CAV1和陰性對照CAVD后檢測可見熒光，轉染效率較高，達到80%以上，見圖1。2.2  轉染前后4種細胞株3GalT7和caveolin1的mRNA表達變化情況     在這4種實質腫瘤細胞中，3GalT7和caveolin1均有表達。轉染caveolin1反義核苷酸后的4種細胞株3GalT7和caveolin1的mRNA表達情況與未轉染前相比，3GalT7的mRNA表達有明顯增加，陰性對照組變化不大；轉染caveolin1反義核苷酸CAV