新生兒臍帶血CD4+CD25high調節(jié)性T細胞Foxp3的表達

1、新生兒臍帶血CD4+CD25high調節(jié)性T細胞Foxp3的表達                          作者：唐潔, 李柏青, 阮潔, 張林杰【摘要】  目的: 檢測新生兒臍帶血CD4+CD25high調節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量及胞內轉錄因子Foxp3的表達, 探討Treg細胞在新生兒期的表達特點。方法: 采集新生兒臍帶血（

2、n=15）和成人外周血（n=12）, 密度梯度離心法獲取單個核細胞用熒光標記單克隆抗體（mAb）作表面和胞內染色后, 在流式細胞儀上檢測CD4+CD25highTreg細胞的數(shù)量及其胞內轉錄因子Foxp3的表達。結果: 臍帶血Treg細胞占CD3+CD4+T細胞的比例（3.86%±1.63%）明顯高于成人外周血（0.87%±0.74%, P<0.01); 而臍帶血Treg細胞中表達Foxp3的比例明顯低于外周血Treg細胞（23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%, P<0.01）。結論: 雖然新生兒臍帶血CD4+CD25high

3、Treg細胞數(shù)量明顯高于成人外周血, 但Foxp3+細胞數(shù)量明顯低于成年人, 提示在功能上可能尚未成熟。 【關鍵詞】  調節(jié)性T細胞 轉錄因子 新生兒臍帶血Abstract  AIM:  To investigate the amount of CD4+CD25high Treg cells and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood, and to analyze the expression of Treg cells in neonates. METHODS: The mononuclear cell

4、s from cord blood or peripheral blood were isolated from neonatal cord blood (n=15) or healthy adults peripheral blood (n=12) by density gradient centrifugation. Then they were stained with fluorescence labeled monoclonal antibodies for cell surface and intracellular protein. The amount of CD4+CD25h

5、igh Treg cells and intercellular transcription factor Foxp3 were measured by flow cytometry. RESULTS:  The amount of CD4+CD25high Treg cells in CD3+CD4+ T cells in cord blood was significantly higher than that in adults peripheral blood (3.86%±1.63% vs 0.87%±0.74%,  P<0.01), w

6、hereas the expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood was markedly lower than in   adults blood (23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%,  P<0.01). CONCLUSION:  The low expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood suggests Treg cells in neonates

7、are not mature in suppression.KeywordsRegulatory T cell; transcription factor;  neonate cord blood1995年, Sakaguchi等1發(fā)現(xiàn)正常人外周血及脾臟的CD4+T細胞中存在著一類調節(jié)性T細胞, 特征性高表達IL-2受體a鏈（CD25分子）, 這種CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（regulatory T cell, Treg細胞）在免疫應答的負調節(jié)及維持機體內環(huán)境穩(wěn)定和誘導機體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。其后有研究結果顯示在成人外周血中僅CD4+CD25high Treg細胞具有抑制功

8、能2。近幾年來, 許多研究表明轉錄因子Foxp3（forkhead box p3, Scurfin）在CD4+CD25highTreg細胞的發(fā)育和功能維持上發(fā)揮著重要作用3, 4。但目前對Treg細胞的發(fā)生、 發(fā)育、 成熟及其功能的分子機制尚不清楚。為了解Treg細胞生長發(fā)育特點,  我們采用流式細胞術對新生兒臍帶血和成人外周血中CD4+CD25highTreg細胞數(shù)量及胞內轉錄因子Foxp3進行測定, 初步探討Treg細胞在新生兒期的表達特點。1  材料和方法1.1  材料  流式細胞儀（FACSCalibur）為BD公司產品; 低溫離心機（Eppen

9、dorf 5810R）為德國產品; 培養(yǎng)基（RPMI1640）為Gibco公司產品; 新生小牛血清(NBS)為杭州四季青生物公司產品; 淋巴細胞分離液（Ficoll-Hypaque, 比重1.077±0.002）為醫(yī)學院生物工程研究所產品; 多聚甲醛、 皂素（Saponin）均為Sigma公司產品; 抗人Foxp3-FITC單克隆抗體（mAb）購自BioLegend公司; 抗人CD3-APC mAb、 抗人CD25-PE mAb及抗人CD4-PeCy5.5 mAb及相應熒光標記的小鼠同型對照均購自Invitrogen-Caltag公司。新生兒臍帶血采自蚌埠醫(yī)學院第二附屬和蚌埠市中心醫(yī)

10、院婦產科足月健康新生兒, 其中男嬰8例, 女嬰7例。胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入肝素鈉抗凝管。成人外周血來自本校12例健康教職工和學生, 其中男6例, 女6例,年齡2035歲。所有血樣標本均在采樣后4 h內送達實驗室。1.2  方法1.2.1  臍血和成人外周血單個核細胞的制備  常規(guī)密度梯度離心法分離臍血和成人外周血單個核細胞, 用含50 mL/L NBS-50 mL/L人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞密度為1×109/L。1.2.2  熒光抗體染色  取上述制備的細胞懸液加入流式管, 每管3×105個

11、細胞(300 L); 用染色緩沖液（PBS,  pH7.2,  含50 mL/L NBS和1 g/L NaN3）1 500  r/min,  5 min洗1次, 離心后棄上清; 利用殘留液體（30 L/管）重懸細胞后,  加抗人CD3-APC、抗人CD25-PE和抗人CD4-PeCy5.5作細胞表面染色4  30 min; 加染色緩沖液1 mL/管, 洗2次; 用20 g/L PFA  500 L/管,  于4固定30    min; 離心后棄上清; 用染色緩沖液1 mL/管,

12、0; 洗2次棄上清; 加透膜緩沖液（PBS,   pH7.2,  含1 g/L Saponin,  100 mL/L NBS和1 g/L  NaN3） 500  L/管,  4  15 min; 1 700  r/min, 7 min離心后棄上清（使殘留細胞懸液50 L/管）；加入抗人Foxp3-FITC染色, 4  30 min; 透膜緩沖液1  mL/管, 洗1次；染色緩沖液1 mL/管,  洗1次; 加10 g/L PFA  300 L, 流式細胞術檢測。同樣

13、處理的細胞設置未加熒光抗體對照管、 僅作表面染色的用3種熒光抗體（不染胞內Foxp3）對照管, 用小鼠IgG1-FITC作胞內染色的同型對照管, 以及分別用抗CD3-FITC、 抗CD4-PE、 抗CD3-PeCy5.5或抗CD3-APC作單色熒光抗體染色作為調試流式細胞儀熒光補償管。1.2.3  流式細胞術檢測胞內轉錄因子數(shù)據(jù)獲取及分析  在流式細胞儀上用Cellquest軟件檢測待檢樣品, 利用未染色管和單色熒光抗體染色管設置PMT電壓和熒光補償, 利用同型對照管區(qū)分是否有非特異性染色, 利用不染胞內陰性對照管設置陰陽性界限, 然后對待測樣品進行檢測。每管測定獲取105

14、個細胞的數(shù)據(jù)。在用Cellquest軟件分析結果時, 首先在前向散射光(FSC)和側向散射光(SSC)點陣圖上劃定淋巴細胞區(qū)域R1, 然后在FL-4（CD3APC）和FL-3（CD4 PeCy5.5）點陣圖上劃定CD3+CD4+細胞區(qū)域為R2, 在FL-3（CD4 PeCy5.5）和FL-2（CD25 PE）點陣圖上劃定CD25high為R3, CD25int為R4, CD25-為R5, 然后分別設門G3（R1*R2*R3）, G4（R1*R2*R4）, G5（R1*R2*R5）, 在直方圖上檢測分析不同細胞亞群的胞內轉錄因子Foxp3的表達。1.2.4  統(tǒng)計學處理  同

15、一組數(shù)據(jù)以x±s表示, 不同組之間的數(shù)據(jù)差異用t檢驗作比較。1         2  結果2.1  臍帶血和成人外周血CD4+CD25highTreg細胞的比例  新生兒臍帶血CD4+T細胞中CD25陽性和陰性細胞分界明顯, 形成兩個不同群體, 而成年人外周血中CD4+T細胞中CD25陽性和陰性細胞分界不明顯, 呈過渡型（圖1）。對CD25陽性細胞再根據(jù)表達強度分為高表達（CD25high）和低/中度表達（CD25int）, 通常將CD4+CD25high細胞作為Treg細胞

16、, 則發(fā)現(xiàn)臍帶血CD4+CD25highTreg細胞占CD3+CD4+T細胞的比例（3.86±1.63）%明顯高于成人外周血CD4+CD25highTreg細胞（0.87±0.74）% (P<0.01, 表1)。表1  臍帶血和成人外周血CD4+T細胞各亞群比例及其Foxp3的表達（略）Tab 1  CD3+CD4+ T cell subsets and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood and adults peripheral bloodaP<0.05,  bP<

17、0.01 vs cord blood.2.2  轉錄因子Foxp3在臍帶血和成人外周血CD4+CD25highTreg細胞中的表達  新生兒臍帶血CD4+CD25highTreg細胞中表達Foxp3的細胞比例（23.21±8.90）%明顯低于成人外周血CD4+CD25highTreg細胞中的比例（71.30±11.60）%（P<0.01）; 而臍帶血CD4+CD25int細胞中表達Foxp3的細胞比例（9.06±5.20）%, 也低于成人外周血CD4+CD25int細胞中的比例（15.99±6.90）%（P<0.05,&#

18、160; 圖1）。圖1  臍帶血和成人外周血中CD4+CD25highTreg細胞Foxp3表達的流式細胞術分析（略）Fig 1  FCM analysis of the expression of Foxp3 in CD4+CD25high T cells in cord blood and adults peripheral bloodA: Cord  blood; B: Adults  peripheral blood2.3  Foxp3的表達與CD25熒光強度呈正相關  我們將CD4+CD25+細胞按CD25熒光強度由高到低劃

19、分為2%、 2%4%、4%6%、 6%8%和8%10%  5組, 使每組細胞數(shù)占CD4+CD25+細胞的2%, 對其表達Foxp3的比例進行比較發(fā)現(xiàn), 臍帶血和成人外周血Foxp3的表達均與CD25熒光強度呈正相關, 且在各組成人外周血Foxp3的表達均高于臍帶血（圖2）。圖2  臍血和成人外周血CD4+CD25+細胞中CD25分子與Foxp3表達（略）Fig 2  The expression of CD25 and Foxp3 in CD4+CD25+ T cells in cord blood and adults  peripheral bloo

20、d3  討論    CD4+CD25+Treg細胞組成性高表達CD25分子（IL-2受體a鏈）、 CD152（CTLA-4）、 CD122、 Neuropilin-1（Nrp-1）5、 GITR（TNFRSF-18）6等, 但這些分子在活化的CD4+效應T細胞上也有表達, 因此缺乏特異性。由Foxp3基因編碼的具有插頭螺旋結構的轉錄因子Foxp3高表達在CD4+CD25+Treg細胞中, 在CD8+ T細胞和CD4+CD25-T細胞中少量表達7。盡管目前對Foxp3是Treg細胞的特異性標志的觀點仍存在爭議, 但許多研究證實Foxp3是CD4+CD25+

21、Treg細胞發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制功能的關鍵因子。本研究結果顯示, CD25highT細胞高表達Foxp3（在成人外周血約有71%）, 而CD25intT細胞僅部分表達（在成人外周血約有16%）, 在CD25-T細胞僅少量表達（在成人外周血約有1%）, 因此我們認為CD4+Treg細胞中CD4+CD25highTreg細胞是發(fā)揮免疫調節(jié)功能的主要細胞。    在本實驗中, 流式細胞術結果顯示新生兒臍帶血CD4+T細胞中CD25陽性和陰性細胞明顯形成兩個群體, 而成年人外周血CD4+T細胞中CD25陽性和陰性細胞顯示為一個連續(xù)的細胞群。此外, 在臍帶血CD4+CD25h

22、igh與CD4+CD25intT細胞之間也有清晰的分界, 且在數(shù)量上明顯多于成人外周血（4%  vs 1%）, 這與其他研究者的報道相同8。但我們通過檢測細胞胞內Foxp3表達發(fā)現(xiàn)數(shù)量上占優(yōu)勢的臍帶血CD4+CD25high細胞表達Foxp3比例卻遠遠低于成人外周血。另外我們把臍帶血和成人外周血CD4+CD25+細胞按CD25熒光強度由高到低分為5組進行比較發(fā)現(xiàn)在各組臍帶血Foxp3表達均低于后者。究其原因可能與新生兒臍帶血細胞是很少受到抗原刺激的初始T細胞, 僅少量發(fā)育成熟有關。盡管在胎兒胸腺一部分CD4+細胞被高親和力的自身MHC/肽復合體以陰性選擇的方式活化且表達CD25分子,

23、 但其必須在外周通過抗原的再刺激才能逐漸獲得抑制功能9。因此, 我們認為Foxp3可以作為CD4+Treg細胞功能成熟的特異性標志。臍帶血CD4+CD25highTreg細胞低表達Foxp3, 提示在功能上可能尚未成熟。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)隨著CD25熒光強度增加, Foxp3表達百分比亦增加。我們推測這可能與IL-2信號轉導有關, IL-2/IL-2R相互作用促進了Foxp3的上調和CD25分子的表達10, 其具體機制有待進一步研究。    如何將幼稚且易于分離的臍帶血CD4+CD25high Treg細胞的功能誘導成熟無疑對自身免疫病、 變態(tài)反應性疾病及抑制同種異體移植排斥等臨床應用具有重要意義。致謝: 感謝蚌埠市中心婦產科醫(yī)護人員提供新生兒臍帶血標本?！尽?#160; 1 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al