新生兒臍帶血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)

1、新生兒臍帶血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3的表達(dá)                          作者：唐潔, 李柏青, 阮潔, 張林杰【摘要】  目的: 檢測新生兒臍帶血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量及胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá), 探討Treg細(xì)胞在新生兒期的表達(dá)特點(diǎn)。方法: 采集新生兒臍帶血（

2、n=15）和成人外周血（n=12）, 密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞用熒光標(biāo)記單克隆抗體（mAb）作表面和胞內(nèi)染色后, 在流式細(xì)胞儀上檢測CD4+CD25highTreg細(xì)胞的數(shù)量及其胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。結(jié)果: 臍帶血Treg細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞的比例（3.86%±1.63%）明顯高于成人外周血（0.87%±0.74%, P<0.01); 而臍帶血Treg細(xì)胞中表達(dá)Foxp3的比例明顯低于外周血Treg細(xì)胞（23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%, P<0.01）。結(jié)論: 雖然新生兒臍帶血CD4+CD25high

3、Treg細(xì)胞數(shù)量明顯高于成人外周血, 但Foxp3+細(xì)胞數(shù)量明顯低于成年人, 提示在功能上可能尚未成熟。 【關(guān)鍵詞】  調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子 新生兒臍帶血Abstract  AIM:  To investigate the amount of CD4+CD25high Treg cells and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood, and to analyze the expression of Treg cells in neonates. METHODS: The mononuclear cell

4、s from cord blood or peripheral blood were isolated from neonatal cord blood (n=15) or healthy adults peripheral blood (n=12) by density gradient centrifugation. Then they were stained with fluorescence labeled monoclonal antibodies for cell surface and intracellular protein. The amount of CD4+CD25h

5、igh Treg cells and intercellular transcription factor Foxp3 were measured by flow cytometry. RESULTS:  The amount of CD4+CD25high Treg cells in CD3+CD4+ T cells in cord blood was significantly higher than that in adults peripheral blood (3.86%±1.63% vs 0.87%±0.74%,  P<0.01), w

6、hereas the expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood was markedly lower than in   adults blood (23.21%±8.9% vs 71.3%±11.6%,  P<0.01). CONCLUSION:  The low expression of Foxp3 in CD4+CD25high Treg cells in cord blood suggests Treg cells in neonates

7、are not mature in suppression.KeywordsRegulatory T cell; transcription factor;  neonate cord blood1995年, Sakaguchi等1發(fā)現(xiàn)正常人外周血及脾臟的CD4+T細(xì)胞中存在著一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞, 特征性高表達(dá)IL-2受體a鏈（CD25分子）, 這種CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Treg細(xì)胞）在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮著重要作用。其后有研究結(jié)果顯示在成人外周血中僅CD4+CD25high Treg細(xì)胞具有抑制功

8、能2。近幾年來, 許多研究表明轉(zhuǎn)錄因子Foxp3（forkhead box p3, Scurfin）在CD4+CD25highTreg細(xì)胞的發(fā)育和功能維持上發(fā)揮著重要作用3, 4。但目前對Treg細(xì)胞的發(fā)生、 發(fā)育、 成熟及其功能的分子機(jī)制尚不清楚。為了解Treg細(xì)胞生長發(fā)育特點(diǎn),  我們采用流式細(xì)胞術(shù)對新生兒臍帶血和成人外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞數(shù)量及胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3進(jìn)行測定, 初步探討Treg細(xì)胞在新生兒期的表達(dá)特點(diǎn)。1  材料和方法1.1  材料  流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）為BD公司產(chǎn)品; 低溫離心機(jī)（Eppen

9、dorf 5810R）為德國產(chǎn)品; 培養(yǎng)基（RPMI1640）為Gibco公司產(chǎn)品; 新生小牛血清(NBS)為杭州四季青生物公司產(chǎn)品; 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hypaque, 比重1.077±0.002）為醫(yī)學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品; 多聚甲醛、 皂素（Saponin）均為Sigma公司產(chǎn)品; 抗人Foxp3-FITC單克隆抗體（mAb）購自BioLegend公司; 抗人CD3-APC mAb、 抗人CD25-PE mAb及抗人CD4-PeCy5.5 mAb及相應(yīng)熒光標(biāo)記的小鼠同型對照均購自Invitrogen-Caltag公司。新生兒臍帶血采自蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬和蚌埠市中心醫(yī)

10、院婦產(chǎn)科足月健康新生兒, 其中男嬰8例, 女嬰7例。胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入肝素鈉抗凝管。成人外周血來自本校12例健康教職工和學(xué)生, 其中男6例, 女6例,年齡2035歲。所有血樣標(biāo)本均在采樣后4 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。1.2  方法1.2.1  臍血和成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備  常規(guī)密度梯度離心法分離臍血和成人外周血單個(gè)核細(xì)胞, 用含50 mL/L NBS-50 mL/L人自體血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。1.2.2  熒光抗體染色  取上述制備的細(xì)胞懸液加入流式管, 每管3×105個(gè)

11、細(xì)胞(300 L); 用染色緩沖液（PBS,  pH7.2,  含50 mL/L NBS和1 g/L NaN3）1 500  r/min,  5 min洗1次, 離心后棄上清; 利用殘留液體（30 L/管）重懸細(xì)胞后,  加抗人CD3-APC、抗人CD25-PE和抗人CD4-PeCy5.5作細(xì)胞表面染色4  30 min; 加染色緩沖液1 mL/管, 洗2次; 用20 g/L PFA  500 L/管,  于4固定30    min; 離心后棄上清; 用染色緩沖液1 mL/管,

12、0; 洗2次棄上清; 加透膜緩沖液（PBS,   pH7.2,  含1 g/L Saponin,  100 mL/L NBS和1 g/L  NaN3） 500  L/管,  4  15 min; 1 700  r/min, 7 min離心后棄上清（使殘留細(xì)胞懸液50 L/管）；加入抗人Foxp3-FITC染色, 4  30 min; 透膜緩沖液1  mL/管, 洗1次；染色緩沖液1 mL/管,  洗1次; 加10 g/L PFA  300 L, 流式細(xì)胞術(shù)檢測。同樣

13、處理的細(xì)胞設(shè)置未加熒光抗體對照管、 僅作表面染色的用3種熒光抗體（不染胞內(nèi)Foxp3）對照管, 用小鼠IgG1-FITC作胞內(nèi)染色的同型對照管, 以及分別用抗CD3-FITC、 抗CD4-PE、 抗CD3-PeCy5.5或抗CD3-APC作單色熒光抗體染色作為調(diào)試流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償管。1.2.3  流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)獲取及分析  在流式細(xì)胞儀上用Cellquest軟件檢測待檢樣品, 利用未染色管和單色熒光抗體染色管設(shè)置PMT電壓和熒光補(bǔ)償, 利用同型對照管區(qū)分是否有非特異性染色, 利用不染胞內(nèi)陰性對照管設(shè)置陰陽性界限, 然后對待測樣品進(jìn)行檢測。每管測定獲取105

14、個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。在用Cellquest軟件分析結(jié)果時(shí), 首先在前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)點(diǎn)陣圖上劃定淋巴細(xì)胞區(qū)域R1, 然后在FL-4（CD3APC）和FL-3（CD4 PeCy5.5）點(diǎn)陣圖上劃定CD3+CD4+細(xì)胞區(qū)域?yàn)镽2, 在FL-3（CD4 PeCy5.5）和FL-2（CD25 PE）點(diǎn)陣圖上劃定CD25high為R3, CD25int為R4, CD25-為R5, 然后分別設(shè)門G3（R1*R2*R3）, G4（R1*R2*R4）, G5（R1*R2*R5）, 在直方圖上檢測分析不同細(xì)胞亞群的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。1.2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  同

15、一組數(shù)據(jù)以x±s表示, 不同組之間的數(shù)據(jù)差異用t檢驗(yàn)作比較。1         2  結(jié)果2.1  臍帶血和成人外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞的比例  新生兒臍帶血CD4+T細(xì)胞中CD25陽性和陰性細(xì)胞分界明顯, 形成兩個(gè)不同群體, 而成年人外周血中CD4+T細(xì)胞中CD25陽性和陰性細(xì)胞分界不明顯, 呈過渡型（圖1）。對CD25陽性細(xì)胞再根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度分為高表達(dá)（CD25high）和低/中度表達(dá)（CD25int）, 通常將CD4+CD25high細(xì)胞作為Treg細(xì)胞

16、, 則發(fā)現(xiàn)臍帶血CD4+CD25highTreg細(xì)胞占CD3+CD4+T細(xì)胞的比例（3.86±1.63）%明顯高于成人外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞（0.87±0.74）% (P<0.01, 表1)。表1  臍帶血和成人外周血CD4+T細(xì)胞各亞群比例及其Foxp3的表達(dá)（略）Tab 1  CD3+CD4+ T cell subsets and the expression of Foxp3 in neonatal cord blood and adults peripheral bloodaP<0.05,  bP<

17、0.01 vs cord blood.2.2  轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在臍帶血和成人外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞中的表達(dá)  新生兒臍帶血CD4+CD25highTreg細(xì)胞中表達(dá)Foxp3的細(xì)胞比例（23.21±8.90）%明顯低于成人外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞中的比例（71.30±11.60）%（P<0.01）; 而臍帶血CD4+CD25int細(xì)胞中表達(dá)Foxp3的細(xì)胞比例（9.06±5.20）%, 也低于成人外周血CD4+CD25int細(xì)胞中的比例（15.99±6.90）%（P<0.05,&#

18、160; 圖1）。圖1  臍帶血和成人外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞Foxp3表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析（略）Fig 1  FCM analysis of the expression of Foxp3 in CD4+CD25high T cells in cord blood and adults peripheral bloodA: Cord  blood; B: Adults  peripheral blood2.3  Foxp3的表達(dá)與CD25熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)  我們將CD4+CD25+細(xì)胞按CD25熒光強(qiáng)度由高到低劃

19、分為2%、 2%4%、4%6%、 6%8%和8%10%  5組, 使每組細(xì)胞數(shù)占CD4+CD25+細(xì)胞的2%, 對其表達(dá)Foxp3的比例進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn), 臍帶血和成人外周血Foxp3的表達(dá)均與CD25熒光強(qiáng)度呈正相關(guān), 且在各組成人外周血Foxp3的表達(dá)均高于臍帶血（圖2）。圖2  臍血和成人外周血CD4+CD25+細(xì)胞中CD25分子與Foxp3表達(dá)（略）Fig 2  The expression of CD25 and Foxp3 in CD4+CD25+ T cells in cord blood and adults  peripheral bloo

20、d3  討論    CD4+CD25+Treg細(xì)胞組成性高表達(dá)CD25分子（IL-2受體a鏈）、 CD152（CTLA-4）、 CD122、 Neuropilin-1（Nrp-1）5、 GITR（TNFRSF-18）6等, 但這些分子在活化的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞上也有表達(dá), 因此缺乏特異性。由Foxp3基因編碼的具有插頭螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3高表達(dá)在CD4+CD25+Treg細(xì)胞中, 在CD8+ T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞中少量表達(dá)7。盡管目前對Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志的觀點(diǎn)仍存在爭議, 但許多研究證實(shí)Foxp3是CD4+CD25+

21、Treg細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵因子。本研究結(jié)果顯示, CD25highT細(xì)胞高表達(dá)Foxp3（在成人外周血約有71%）, 而CD25intT細(xì)胞僅部分表達(dá)（在成人外周血約有16%）, 在CD25-T細(xì)胞僅少量表達(dá)（在成人外周血約有1%）, 因此我們認(rèn)為CD4+Treg細(xì)胞中CD4+CD25highTreg細(xì)胞是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的主要細(xì)胞。    在本實(shí)驗(yàn)中, 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示新生兒臍帶血CD4+T細(xì)胞中CD25陽性和陰性細(xì)胞明顯形成兩個(gè)群體, 而成年人外周血CD4+T細(xì)胞中CD25陽性和陰性細(xì)胞顯示為一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞群。此外, 在臍帶血CD4+CD25h

22、igh與CD4+CD25intT細(xì)胞之間也有清晰的分界, 且在數(shù)量上明顯多于成人外周血（4%  vs 1%）, 這與其他研究者的報(bào)道相同8。但我們通過檢測細(xì)胞胞內(nèi)Foxp3表達(dá)發(fā)現(xiàn)數(shù)量上占優(yōu)勢的臍帶血CD4+CD25high細(xì)胞表達(dá)Foxp3比例卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于成人外周血。另外我們把臍帶血和成人外周血CD4+CD25+細(xì)胞按CD25熒光強(qiáng)度由高到低分為5組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)在各組臍帶血Foxp3表達(dá)均低于后者。究其原因可能與新生兒臍帶血細(xì)胞是很少受到抗原刺激的初始T細(xì)胞, 僅少量發(fā)育成熟有關(guān)。盡管在胎兒胸腺一部分CD4+細(xì)胞被高親和力的自身MHC/肽復(fù)合體以陰性選擇的方式活化且表達(dá)CD25分子,

23、 但其必須在外周通過抗原的再刺激才能逐漸獲得抑制功能9。因此, 我們認(rèn)為Foxp3可以作為CD4+Treg細(xì)胞功能成熟的特異性標(biāo)志。臍帶血CD4+CD25highTreg細(xì)胞低表達(dá)Foxp3, 提示在功能上可能尚未成熟。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)隨著CD25熒光強(qiáng)度增加, Foxp3表達(dá)百分比亦增加。我們推測這可能與IL-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān), IL-2/IL-2R相互作用促進(jìn)了Foxp3的上調(diào)和CD25分子的表達(dá)10, 其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。    如何將幼稚且易于分離的臍帶血CD4+CD25high Treg細(xì)胞的功能誘導(dǎo)成熟無疑對自身免疫病、 變態(tài)反應(yīng)性疾病及抑制同種異體移植排斥等臨床應(yīng)用具有重要意義。致謝: 感謝蚌埠市中心婦產(chǎn)科醫(yī)護(hù)人員提供新生兒臍帶血標(biāo)本?！尽?#160; 1 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al