免疫組化染色操作步驟

1、免疫組織化學(xué)染色原理和操作步驟、免疫組織化學(xué)原理免疫組織化學(xué)（IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原一抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用帶有可見標(biāo)記的特異性抗體作為探針，檢測組織和細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種技術(shù)。免疫組化技術(shù)主要有直接法和間接法：直接法是以標(biāo)記的一抗孵育標(biāo)本以檢測其中的抗原成分；間接法則先后加入一抗和二抗，形成抗原一一抗一二抗復(fù)合體以達(dá)到檢測該抗原 的目的，該法因二抗的放大作用而具有較高的敏感性。間接法常用的有過氧化物酶一抗過氧化物酶（PAP法、親和素一生物素一過氧化物酶（ABC法和鏈霉親和素一過氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程對抗體活性的影響，但需要制備過氧化

2、物酶的抗體，與適量過氧化物酶混合形成 PAP復(fù)合物（含3個(gè)酶分子和2個(gè)抗體分子），染色時(shí)依次加入一抗、二抗、PAP復(fù)合物孵育標(biāo)本，最后用 H2O2和二氨基聯(lián)苯（DAB為底物顯示過氧化物酶，即可檢測標(biāo)本中的抗原成分。生物素為含硫的雜環(huán)單羧酸，可通過其羧基與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合， 從而標(biāo)記抗體和酶。親合素又稱抗生物素蛋白，與生物素有很高的親合力，1分子親合素可結(jié)合4分子生物素，ABC法即在此基礎(chǔ)上建立。ABC法與PAP法相似，一抗不標(biāo)記，二抗用生物素標(biāo)記,ABC復(fù)PAP法更高。染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過氧化物酶混合，制成ABC復(fù)合物，并使親合素分子上至少空出一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。在標(biāo)本孵

3、育過一抗和二抗后，再加入合物使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。ABC法的敏感性較圖1.免疫組織化學(xué)基本原理示意圖（引自八年制組織學(xué)與胚胎學(xué) ）SP法與ABC法相似，其不同于ABC法之處在于用生性與親和素相似的鏈親和素標(biāo)記過氧化物酶。在標(biāo)本孵抗和二抗后，加入鏈親和素標(biāo)記的過氧化物酶使其結(jié)合的生物素上，最后加入 DAB進(jìn)行顯色。與親和素相比,和素的結(jié)合力與親和素相似而非特異性結(jié)合較親和素法簡化了操作步驟，同時(shí)也減少了非特異性背景，是目物學(xué)特A-育過一到二抗鏈酶親低。SP前應(yīng)用最為廣泛的免疫綏化染色技術(shù)。、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:1.標(biāo)本準(zhǔn)備圖2. SP法原理 石蠟包埋組織切片：由病理室常規(guī)處理

4、冰凍組織切片：由病理室常規(guī)處理 細(xì)胞爬片：將無菌蓋玻片置于六孔板中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞生長達(dá)到60%以上后取出玻片， 4%多聚甲醛固定 2 h。2. 試劑準(zhǔn)備 抗體選擇單克隆抗體針對單一表位， 具有較高的特異性， 但在該表位破壞后將得不到陽性結(jié)果； 多克隆抗體表位針對多個(gè)表位，可避免單克隆抗體的缺點(diǎn)，但是可能出現(xiàn)非特異性雜交。因此，不論選擇單克隆還是多克隆抗體，最好同時(shí)購買兩個(gè)貨號的抗體，購買抗體時(shí)一 定要明確是能夠做IHC的抗體，抗體說明書上必須有IHC測試結(jié)果。如果該分子文獻(xiàn)報(bào) 道較多，可選擇文獻(xiàn)上常用的經(jīng)典抗體。 二抗試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用二抗試劑盒為 Life Technologies

5、Histostain-Plus Kit (HRP,Broad Spectrum) ，貨號 85-9043 ，一抗反應(yīng)性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。DAB試劑盒目前本實(shí)驗(yàn)室所用為加強(qiáng)型 DAB顯色試劑盒，貨號DAB-2032其他試劑二甲苯、無水乙醇、蘇木素、中性封片樹脂、檸檬酸鈉、AP ES膠 3. 抗體特異性驗(yàn)證所有免疫組化抗體均須 Western blot 驗(yàn)證抗體特異性，并需免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原 定位。4. 耗材準(zhǔn)備免疫組化筆或者蠟筆、蓋玻片、載玻片5. 溶液配制 磷酸鹽緩沖液(PBS10X PBS母液配制72 gNaClNaHP O 12HOgKH2PO4加蒸餾水至 1000 ml ，充分混

6、勻貯存。使用時(shí)用蒸餾水10倍稀釋，調(diào)整pH值至一。檸檬酸抗原修復(fù)液抗原修復(fù)使用檸檬酸 - 磷酸氫二鈉緩沖液，配方如下：稱取檸檬酸g，溶于500 ml蒸餾水；稱取NqHP12HO，溶于800 ml蒸餾水。分別量取358 ml檸檬酸溶液和642 ml NqHPO溶液，充分混勻后調(diào)整pH值至，即得2X母液，貯存?zhèn)溆谩?1 %鹽酸酒精濃鹽酸與 75%酒精按照 1:99 比例混合，充分混勻。三、免疫組化操作步驟1. 組織片脫蠟水化 將組織片依次放入 3個(gè)裝有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸 15 min。 依次放入 2個(gè)裝有無水乙醇的玻璃缸，每缸 5 min 。 依次放入 2個(gè)裝有 95%乙醇的玻璃缸，每

7、缸 5 min。 依次放入90%乙醇、85%乙醇、75匯醇的玻璃缸，每缸2 min，取出。 放入自來水、蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次 2. 抗原修復(fù)將切片浸入1X檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2 min，然后停止加熱讓切片自然冷卻。注意：抗原修復(fù)過度或不足，均會影響最終染色結(jié)果。切片驟冷可致脫片，必須自 然冷卻！3. 封閉內(nèi)源性過氧化氫酶放入 3% H2O2 溶液的玻璃缸中，浸泡15 min 。放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)5 min 。放入PBS緩沖液的玻璃缸中，浸泡4. 抗體雜交甩去PBS余液，將組織片平輔在濕盒中，加正常山羊血清 1滴20卩l(xiāng) （試劑盒中 的A液，根據(jù)組

8、織大小調(diào)整用量）,28C放置20 min，甩干。 加稀釋好的一抗1滴（2050卩I ,根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），置于濕盒4C過夜。 置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗 5 min，更換PBS緩沖液，同法操作4次，甩干。 加入生物素偶聯(lián)的二抗2050卩I （試劑盒中的B液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整）， 放置濕盒，37°C放置20 min。置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5 min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。5. 顯色加鏈親和素-辣根過氧化物酶2050卩I 調(diào)整），濕盒內(nèi)28C放置520 min，甩干。（試劑盒中的C液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行 置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩

9、慢振蕩清洗5 min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。 滴加新鮮配制的DAB工作液100卩I （以覆蓋組織為宜），放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃褐色時(shí)（35 min），置裝有自來水玻璃缸中涮洗 3次；6. 復(fù)染浸入蘇木精溶液中復(fù)染，放置 5 min 后，用自來水反復(fù)涮洗至水不變色，再用1%鹽酸酒精分化 1 2 s 后，自來水沖洗后，反藍(lán)水洗 2 min 。7. 脫水、透明和封片依次放入95%、95%乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出;依次放入2個(gè)無水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出。依次放入2個(gè)裝有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡 5 min，取出。 滴加適量中性樹膠，封片，晾干。8. 注意事項(xiàng)整個(gè)染色過程中組織塊要保持濕潤，不能干片，否則會導(dǎo)致非特異性染色。組織切片邊緣易干，因此抗體、封閉液、顯色液等試劑要充分覆蓋組織塊，避免 干片。四、結(jié)果判定1. 陽性細(xì)胞判斷DAE顯色呈黃色。每批染色都要有特異性陽性和陰性對照為基礎(chǔ)，才能對染色結(jié)果作出判斷?？乖磉_(dá)必須在特定部位，對于臨床診斷來說，不在抗原所在部位的陽性著色， 一概不能視為陽性。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的著色多系內(nèi)源干 擾或人為因素所致，不能視為陽性。2. 抗原表達(dá)評價(jià)免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)， 實(shí)際工作中常采