白細(xì)胞介素-4基因修飾Raji細(xì)胞促進(jìn)腫瘤特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞

1、    白細(xì)胞介素-4基因修飾Raji細(xì)胞 促進(jìn)腫瘤特異細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷活性        【摘要】目的探討人白細(xì)胞介素(IL)-4基因修飾對(duì)伯基特淋巴瘤細(xì)胞株Raji的體外生物學(xué)特性、腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）殺傷活性的影響及其機(jī)制。方法采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法將人IL-4 cDNA導(dǎo)入Raji株并篩選獲得高效價(jià)表達(dá)IL-4的克隆，觀察IL-4表達(dá)克隆形態(tài)學(xué)特征、體外增殖反應(yīng)及其誘導(dǎo)的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖反應(yīng)和IL-2、干擾素(IFN-)

2、基因表達(dá)及CTL殺傷活性。結(jié)果IL-4基因修飾對(duì)Raji的體外生物學(xué)特性無(wú)明顯影響，但明顯促進(jìn)正常人PBMC增殖及IL-2、IFN-基因表達(dá)，其誘導(dǎo)建立的CTL殺傷活性明顯增強(qiáng)，效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞比例為301時(shí)，IL-4基因修飾可使Raji細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL殺傷活性上升23倍。結(jié)論外源性IL-4基因表達(dá)產(chǎn)物可能作用于瘤細(xì)胞和（或）PBMC，通過(guò)誘導(dǎo)IL-2、IFN-等細(xì)胞因子促進(jìn) CTL反應(yīng)，并增強(qiáng)其殺傷活性?！娟P(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素-4伯基特淋巴瘤基因T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性 Stimulation with IL-4 gene modified Raji cells enhances killing

3、activity of tumor-specific cytotoxic T lymphocyteZHAO Xiaodong, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Childrens Hospital, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400014【Abstract】ObjectiveEffects of interleukin-4 (IL-4) gene modification of biological characteristics of Raji cell line and kil

4、ling activity of Raji-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) were investigated. MethodsIL-4 cDNA was amplified from a plasmid, pCD-hIL-4, by polymerase chain reaction (PCR) and transferred into Raji cells via retrovirus-mediated gene transfection method. Proliferation of IL-4-producing Raji clones an

5、d PBMC, IL-2 and IFN- mRNA synthesis and killing activity of Raji cell-induced CTL were determined. ResultsStimulation with IL-4 gene-modified Raji cell increased proliferation and IL-2, IFN- mRNA synthesis of normal PBMC, which could not be blocked by anti-IL-4 monoclonal antibody. The killing acti

6、vity of CTL induced by IL-4 gene modified Raji clones was much stronger than that of controls. ConclusionIL-4 gene modification is capable of enhancing killing activity of Raji-specific CTL by means of up-regulating expression of IL-2 and creating a more suitable environment for antigen-presenting,

7、establishment and maintenance of killing function of CTL.【Key words】Interleukin-4Burkitts lymphomaGenesT-lymphocytes, cytotoxic惡性淋巴瘤在兒科臨床實(shí)踐中并不少見(jiàn)，目前的治療手段尚未取得令人滿意的效果。采用細(xì)胞因子基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫功能，最終徹底清除腫瘤是一種具有潛在臨床價(jià)值的新方法。將其與手術(shù)切除、放療、化療結(jié)合進(jìn)行治療可望大大改善惡性淋巴瘤患兒的預(yù)后。本研究將白細(xì)胞介素(IL-4)基因?qū)氩兀˙urkitt）淋巴瘤株Raji，觀察其體外生物

8、學(xué)特性的改變及對(duì) T細(xì)胞功能的影響，旨在為惡性淋巴瘤的基因與免疫治療提供新線索。材料及方法一、目的基因、載體及宿主菌以含人IL-4 cDNA全序列的質(zhì)粒PCD-hIL-4為模板，用引物Sense 5-AACTCGAGTTAATGGGTCTCA CCTCCCAA-3和Antisense 5-AGGGATCCTATTCAG CTCGAACACTTTGA-3通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得IL-4 cDNA片段，瓊脂糖凝膠電泳回收、純化該片段。用雙脫氧鏈終止法測(cè)序。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PLXSN)由Miller(USA)贈(zèng)送，長(zhǎng)約 5 900堿基對(duì)。宿主菌大腸桿菌Mc 1 061株由作者單位的免疫室保

9、存。二、主要試劑、細(xì)胞株及其來(lái)源內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自Promega公司；脫氧三磷酸核苷(dNTP)、Polybrene、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1 640、DMEM和克隆篩選試劑G 418購(gòu)自Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Dosper及重組IL-4購(gòu)自Boehringer Mannheim公司；51鉻酸鈉(51Cr)購(gòu)自美國(guó)Ameshan公司, 3H-TdR購(gòu)自中國(guó)同位素公司，IL-2、干擾素(IFN-) PCR引物購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；重組 IL-4（rIL-4）、鼠抗人IL-4單克隆抗體及IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Gen

10、zyme公司。病毒包裝細(xì)胞株P(guān)A317及病毒滴度鑒定細(xì)胞株 NIH3T3來(lái)自第三軍醫(yī)大學(xué)分子生物室， Raji為本室常規(guī)傳代培養(yǎng)。三、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建、包裝、篩選及感染人IL-4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建策略如1所示。1IL-4重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建示意堿裂解法抽提質(zhì)粒，酶切、連接、鑒定及細(xì)菌轉(zhuǎn)化等步驟均按 Sambrook等1介紹的標(biāo)準(zhǔn)方法操作。具體步驟為：用平端內(nèi)切酶 HpaI使載體線性化。酚：氯仿抽提純化后與 PCR反應(yīng)擴(kuò)增回收得到的目的基因片段，在T4 DNA連接酶催化作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌-Mc1 061，將其接種于瓊脂平板，待菌落形成后進(jìn)行大腸桿菌擴(kuò)

11、增，抽提質(zhì)粒，酶切后瓊脂糖電泳鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、病毒滴度鑒定及感染 Raji細(xì)胞方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)2。四、表達(dá)IL-4的Raji細(xì)胞克隆篩選及體外生物學(xué)特性觀察用G 418篩選轉(zhuǎn)基因 Raji細(xì)胞克隆1個(gè)月，收集抗性細(xì)胞克隆上清液用ELISA法檢測(cè)IL-4表達(dá)水平。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察抗性Raji克隆形態(tài)學(xué)特征，用3H-TdR摻入法測(cè)定其體外增殖活性。五、Raji細(xì)胞誘導(dǎo)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）增殖及IL-2、IFN-基因表達(dá)常規(guī)分離正常人PBMC，調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/ml，加100 l入55孔板，不同組別加入經(jīng)絲裂霉素C(40 g/L×106細(xì)胞，37

12、，1小時(shí))處理的轉(zhuǎn)基因或?qū)φ?Raji細(xì)胞。 IL-4單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)阻斷組加入終濃度為0.5 g/ml的鼠抗人 IL-4單抗,重組 IL-4組加入終濃度為0.1 g/ml的IL-4，37、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前16小時(shí)加入3H-TdR，液閃計(jì)數(shù)每分鐘脈沖數(shù)(cpm)值。另取1×106 PBMC加入24孔板，分別加入絲裂霉素C處理的腫瘤細(xì)胞1×105/孔（100 l），置37、5%CO2孵箱中培養(yǎng)12、24、48和72小時(shí)后抽提總RNA，用RT-PCR檢測(cè)IL-2和IFN-基因表達(dá)。六、Raji特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)建立及其殺傷活性

13、測(cè)定參照Thomas等3介紹的方法。用 51Cr標(biāo)記野生型腫瘤細(xì)胞（100 ci/1×106細(xì)胞，37過(guò)夜），PBS緩沖液洗滌3次后將濃度調(diào)至1×105/ml作為靶細(xì)胞。采用4小時(shí) 51Cr釋放法測(cè)定CTL殺傷活性。于96孔培養(yǎng)板中加入不同比例的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞（每種比例重復(fù)3孔），37、5%CO2孵育4小時(shí)，1 500 r/min離心5分鐘，收集上清用-計(jì)數(shù)儀測(cè)定其cpm值。按下式計(jì)算CTL殺傷活性，以殺傷率%表示：%殺傷活性=×100結(jié)果一、重組IL-4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建用核酸內(nèi)切酶SacI消化載體出現(xiàn)2片段，消化重組體后2片段大小相近，無(wú)法區(qū)分；DNA內(nèi)切

14、酶EcoR消化重組體出現(xiàn)367 bp小片段，消化載體后無(wú)此片段出現(xiàn)，證實(shí)正向重組的 IL-4逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建成功（2）。2重組IL-4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體酶切鑒定譜二、Raji株表達(dá) IL-4水平及其體外生物學(xué)特征各株Raji細(xì)胞克隆IL-4表達(dá)水平如表1所示。導(dǎo)入IL-4cDNA的Raji細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的最高水平24小時(shí)可達(dá)134.5 pg/106細(xì)胞。普通光學(xué)顯微鏡下觀察IL-4高表達(dá)克隆細(xì)胞形態(tài)、大小與野生型Raji及僅導(dǎo)入載體的Raji細(xì)胞(Raji-neo)相比無(wú)明顯變化。其體外增殖反應(yīng)水平與對(duì)照組比較亦無(wú)明顯差異。表1Raji細(xì)胞表達(dá)IL-4水平及其體外增殖反應(yīng)細(xì)胞株IL-4表達(dá)水平(p

15、g/106細(xì)胞24h)增殖反應(yīng)(cpm)未加組rIL-4組野生型Raji02 2132 376Raji-neo02 4372 643R-IL-412 678-R-IL-422 734-R-IL-432 765-R-IL-441 988-注：-示未檢測(cè)；每一實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次；R-IL-414示IL-4基因修飾的Raji株，下同三、Raji細(xì)胞誘導(dǎo)的正常人PBMC增殖反應(yīng)如表2所示，表達(dá)IL-4的4株Raji克隆誘導(dǎo)的正常人PBMC增殖反應(yīng)明顯強(qiáng)于野生型Raji及Raji-neo誘導(dǎo)者，IL-4單抗不能阻斷。重組人IL-4加入培養(yǎng)系統(tǒng)雖可使PBMC增殖反應(yīng)增強(qiáng)，但其程度遠(yuǎn)不及表達(dá)IL-4的Raji

16、克隆。表2Raji細(xì)胞誘導(dǎo)的正常人PBMC體外增殖反應(yīng)(cpm)誘導(dǎo)細(xì)胞株未加組IL-4單抗組rIL-4組空白對(duì)照412-564野生型Raji619-1 386Raji-neo546-1 748R-IL-413 8653 647-R-IL-423 4673 282-R-IL-433 1803 254-R-IL-442 7892 403-四、Raji細(xì)胞誘導(dǎo)正常人PBMC IL-2、IFN-基因表達(dá)IL-4基因修飾的Raji細(xì)胞可誘導(dǎo)正常人PBMC IL-2和IFN-基因表達(dá)。IL-2基因表達(dá)在刺激后12小時(shí)即可檢測(cè)，維持至48小時(shí)開(kāi)始減弱；IFN-基因刺激后12小時(shí)有較弱表達(dá)，至24小時(shí)達(dá)表達(dá)

17、高峰，48小時(shí)后開(kāi)始減弱（3、4）。野生型Raji、Raji-neo、加入rIL-4共培養(yǎng)的Raji及單獨(dú)加入rIL-4均未能誘導(dǎo)上述基因表達(dá)。 1：Raji-rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-4；5：Marker3R-IL-41誘導(dǎo)的正常人PBMC IL-2基因表達(dá)1：Raji+rIL-4；2：Raji-neo；3：R-IL-4，24h；4：R-IL-41；12h；5：Marker4R-Il-41誘導(dǎo)的正常人PBMC IFN-基因表達(dá)五、CTL的殺傷活性野生型Raji細(xì)胞和Raji-neo僅能誘導(dǎo)輕度CTL殺傷活性。各種效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞比例兩者誘導(dǎo)的殺

18、傷活性無(wú)顯著差異。R-IL-41細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL殺傷活性明顯增強(qiáng)，并隨效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞比例的升高而增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例為301時(shí)Raji-neo、野生型Raji及R-IL-41誘導(dǎo)的CTL殺傷效率分別為(20.3±6.2)%、(20.8±4.3)%和(48.8±10.4)%。 討論細(xì)胞因子與機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)密切相關(guān)，已證實(shí)諸多細(xì)胞因子在腫瘤局部表達(dá)可激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，提示細(xì)胞因子基因修飾腫瘤疫苗具有潛在的臨床應(yīng)用前景。 IL-4是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，前期研究發(fā)現(xiàn) IL-4基因修飾的小鼠實(shí)體瘤細(xì)胞可增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)4；重組 IL-4可

19、明顯抑制新鮮分離的非何杰金淋巴瘤細(xì)胞體外增殖反應(yīng)5，提示 IL-4既可能直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖或促進(jìn)其細(xì)胞凋亡過(guò)程6，亦可上調(diào)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn) IL-4基因修飾 Raji細(xì)胞誘導(dǎo)的正常人PBMC增殖反應(yīng)及 IL-2， IFN-基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，而加入培養(yǎng)系統(tǒng)的重組 IL-4卻無(wú)此作用。提示由腫瘤細(xì)胞自分泌的 IL-4可能更有效地作用于瘤細(xì)胞本身和(或) PBMC，最終促進(jìn)PBMC增殖并表達(dá)一些有利于抗原提呈、 CTL反應(yīng)建立及 CTL殺傷活性的細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而有利于機(jī)體有效清除腫瘤。IL-2能促進(jìn) T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo) T細(xì)胞分泌一系列細(xì)胞因子，亦為CD8+CTL維持殺傷活

20、性必需的生長(zhǎng)因子，故推測(cè)其可能為 IL-4基因修飾瘤苗促進(jìn) CTL殺傷活性的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。IL-4主要來(lái)源于TH2細(xì)胞，具有誘導(dǎo)T細(xì)胞向TH2方向分化并產(chǎn)生TH2類細(xì)胞因子的功能。本研究發(fā)現(xiàn)IL-4基因修飾瘤苗主要誘導(dǎo)正常人PBMC產(chǎn)生 IL-2、 IFN-等TH1細(xì)胞類細(xì)胞因子, 而用rIL-4或rIL-4加腫瘤細(xì)胞則未能誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生上述細(xì)胞因子, 提示腫瘤細(xì)胞分泌的 IL-4可能并未直接作用于 T細(xì)胞。我們推測(cè)IL-4基因修飾 Raji細(xì)胞所致的繼發(fā)因素,如腫瘤細(xì)胞膜表面某些抗原的改變, 可能激活 T淋巴細(xì)胞受體, 從而誘導(dǎo)建立TH1應(yīng)答。 CTL是抗腫瘤免疫網(wǎng)絡(luò)中最特異、最重要的效應(yīng)細(xì)胞，本研究結(jié)果為 IL-4基因修飾淋巴瘤疫苗的使用提供了線索，但尚需在體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)。本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：39470733）及衛(wèi)生部科研課題基金資助（編號(hào)：96-1-366）作者單位：400014 重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院參考文獻(xiàn)1Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press