益智健腦顆粒對SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

1、    益智健腦顆粒對SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的影響作者：蔣美艷 董克禮 肖 嵐 羅柳陽    作者單位：中南大學(xué)湘雅第三醫(yī)院,湖南 長沙【摘要】  目的 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察益智健腦顆粒對SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，從而探討益智健腦顆粒治療阿爾茨海默病(AD)的部分作用機(jī)制。方法 將6月齡SAMP8 20只隨機(jī)分為治療組(n=10)和對照組(n=10)，治療組以益智健腦顆粒濃縮液灌胃，對照組以等劑量雙蒸水灌胃。8 w后，應(yīng)用雙向凝膠電泳(2DE)技術(shù)分別分離治療組和對照組SAMP8海馬區(qū)組織總蛋白，

2、經(jīng)膠體考馬斯亮藍(lán)染色，利用ImageScanner圖像掃描儀及ImageMaster雙向凝膠電泳軟件對圖像進(jìn)行掃描分析，將有意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOFMS)分析得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，經(jīng) MSDB和NCBI數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果 鑒定出治療組13個(gè)差異表達(dá)大于2倍的蛋白質(zhì)，其中有8個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)。結(jié)論 益智健腦顆?？烧{(diào)節(jié)SAMP8小鼠海馬組織的多種蛋白質(zhì)表達(dá),提示該藥具有多靶點(diǎn)治療的作用。【關(guān)鍵詞】  益智健腦顆粒；SAMP8小鼠；海馬；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜分析 Effect of Yizhijiannaogra

3、nule on expression of hippocampus proteomics in senescence accelerated mouse8    JIANG MeiYan，DONG KeLi，XIAO Lan,et al.    Department of Traditional Chinese Medicine，the 3rd Affiliated Hospital of XangYa Medical School,Central South University，Changsha  410013，Huna

4、n，China    【Abstract】  Objective  To explore the remedial effect of Yizhijiannaogranules  probable mechanism on Alzheimers disease (AD).Methods  6monthold SAMP8 rats(n=20) were randomly divided into treated group(n=10) and control group(n=10).Rats in treated group

5、were treated with Yizhijiannaogranule and those in control group treated with double distilled water.Eight weeks later，total protein in hippocampus tissue were separated and identified.Results  13 Differentially expressed protein spots which were more than two folds were identified，of which 8 p

6、rotein spots were upregulated and five protein spots were down  Multiple hippocampus protein spots of SAMP8 mice can be regulated by Yizhijiannaogranule，showing Yizhijiannaogranule has a multitarget remedial mechanism of AD.    【Key words】  Yizhijiannaogranule;SAMMP8 mice;Hi

7、ppocampus;Twodimensional gel electrophoresis;Mass spectroscopy      益智健腦顆粒是董克禮教授多年臨床實(shí)踐治療阿爾茨海默病(AD)的中藥處方，臨床上用于治療AD之腎虛血瘀型,取得滿意療效1，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究能改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力2。本研究則在臨床觀察及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定益智健腦顆粒干預(yù)前后 P8 品系快速老化小鼠(SAMP8)海馬組織的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，試圖從蛋白質(zhì)組水平探討中藥益智健腦顆粒治療 AD 的作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 

8、;   1  材料與方法    1.1  動(dòng)物及分組  選用6月齡 20只雄性SAMP8小鼠，隨機(jī)分為治療組和對照組,每組各10只，由天津中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物部提供。    1.2  藥物、試劑與儀器  益智健腦顆粒由淫羊藿、鎖陽、川斷、田七等組成，其水提濃縮液，相當(dāng)于1 ml含3 g生藥，由湖南德康制藥有限公司加工制成。雙向凝膠電泳試劑：2D Quant Kit蛋白定量試劑盒，尿素，硫脲，NP40，Triton X100，二硫蘇糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干膠

9、條（pH310，24 cm），IPG 緩沖液（pH310），兩性電解質(zhì)（pH310），覆蓋液，雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G250,溴酚藍(lán)均為瑞典Amersham Biosciences公司產(chǎn)品；瓊脂糖，過硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸鈉，碳酸氫銨，三氟乙酸、乙腈和基質(zhì)氰基4羥基肉桂酸均為美國SigmaAldrich公司產(chǎn)品。胰蛋白酶，美國Promega公司產(chǎn)品。PDQuest雙向凝膠圖譜分析軟件是美國BioRad公司產(chǎn)品，Mascot MS/MS數(shù)據(jù)庫查詢軟件是英國Matrixscience公司產(chǎn)品，IPGphor等電聚焦儀，Ima

10、gescanner掃描儀均為瑞典Amersham Biosciences公司產(chǎn)品，Data Explorer 質(zhì)譜分析軟件，VoyagerDE STR 4307 MALDITOFMS質(zhì)譜儀是美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品。    1.3  方法    1.3.1  動(dòng)物喂養(yǎng)及標(biāo)本收集  治療組和對照組小鼠喂養(yǎng)于層流室，溫度1822，濕度55%58%，飲水及飼料高溫蒸汽滅菌。小鼠灌胃劑量每天30 g/kg 計(jì)算。治療組給予中藥益智健腦顆粒濃縮液灌胃，1次/d。對照組給予相同體積的雙蒸水灌胃，

11、1次/d，持續(xù)8 w。8 w后，迅速斷頭處死治療組和對照組小鼠，置于冰上，剝出腦組織，用冷生理鹽水沖洗干凈，除去血漬，取出所需的海馬，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。    1.3.2  海馬組織總蛋白的提取及濃度測定  將海馬組織從液氮中取出，立即放入預(yù)先稱重的EP管中進(jìn)行稱重。然后根據(jù)50 mg樣品組織加入約400 l組織裂解液的比例加入組織裂解液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲，2% NP40，1%Triton  X100，0.5 mmol/L EDTA，40 mmol/L Tris，4%CHAPS，100 mmol/

12、L DTT，5 mmol/L PMSF）混合后，用研磨工具使海馬組織充分研磨裂解，室溫下靜置孵育1 h，間或渦旋混勻，然后1 200 r/min，4離心1 h，吸取上清即為組織的總蛋白質(zhì)。取少許（5 l）上清液（組織總蛋白質(zhì)）測定蛋白質(zhì)濃度。采用Amersham Biosciences公司專門針對蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)抽提設(shè)計(jì)的2D Quant Kit定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。    1.3.3  雙向凝膠電泳  每塊膠的上樣量1 500 g。將膠條槽放置于平臺上，將樣品加入膠條槽中，取出IPG干膠條（pH310）置入含蛋白質(zhì)樣品的膠條槽中，再

13、將膠條槽平行放置于IPGphor等電聚焦儀上進(jìn)行第一向電泳。等電聚焦電泳結(jié)束后，將膠條先后放在平衡緩沖A液(平衡緩沖貯液10 mlDTT100 mg)和平衡緩沖B液(平衡緩沖貯液10 ml碘乙酰胺250 mg)中各平衡15 min。然后將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的PAGE分離膠上端，進(jìn)行第二向電泳。    1.3.4  圖像染色與掃描  將凝膠從玻璃板上剝離下來，雙蒸水清洗干凈后用考馬斯亮藍(lán)G250的藍(lán)銀染色方法進(jìn)行藍(lán)銀顯色，通過掃描儀及掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像，使用PDQuest圖像分析軟件進(jìn)行凝膠圖像分析。   

14、1.3.5  質(zhì)譜分析  將蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切取下來，脫色、酶解后對樣品萃取、點(diǎn)樣。用MALDITOFMS質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），再利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。    2  結(jié)  果    得到背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的2DE圖譜各3張。每張2DE圖譜約有900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置和豐度上是一致的，主要分布在pH48的范圍內(nèi)。選擇差異在兩倍以上的16個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)作為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，最后得到鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)為13個(gè)(各個(gè)蛋白具體在凝膠上

15、的分布見圖1)。這些蛋白質(zhì)的功能分別涉及到細(xì)胞骨架蛋白、代謝相關(guān)酶類、信號傳導(dǎo)和激素等多個(gè)方面。在治療組中表達(dá)上調(diào)的有8個(gè)，分別為1、2、4、5、9、10、11、13號蛋白，表達(dá)下調(diào)的有5個(gè)，分別為3、6、7、8、12號蛋白。每個(gè)蛋白的具體情況見表1。 表1  差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息    3  討  論    AD發(fā)病機(jī)制現(xiàn)存在多種假說：能量代謝障礙、激素缺乏、細(xì)胞凋亡、淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性作用、炎癥、自由基損傷等。本實(shí)驗(yàn)鑒定的13種蛋白質(zhì)點(diǎn)，分別涉及到能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、激素等多個(gè)方面。肽酰脯氨酰

16、順反式異構(gòu)酶A (Pin1)屬于微小菌素蛋白的一種酶，Pin1蛋白是一種相對大分子量(18 kD)的肽酰脯氨酰異構(gòu)酶。 Pin1與磷酸化的微管相關(guān)蛋白(tau)蛋白結(jié)合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，這樣就使Pin1過多結(jié)合于纖維結(jié)上，使可利用的游離Pin1減少或缺乏，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這可能是AD發(fā)病機(jī)制之一35。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢復(fù)tau 蛋白使微管聚集的生物學(xué)特征，即加入的Pin1與磷酸化的tau蛋白結(jié)合，使其異構(gòu)化，成為磷蛋白磷酸酶2A型(Protein Phosphatase 2A,PP2A)的最適底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，從而恢復(fù)tau

17、蛋白使微管蛋白聚集的生物學(xué)功能，減少神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成6。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的關(guān)鍵酶，PGK基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致智力減退7，這個(gè)酶是一個(gè)有重要價(jià)值的、具有潛力的藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)8。    近年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過多種途徑和環(huán)節(jié)影響 AD 的發(fā)生和發(fā)展 9，10。流行病學(xué)調(diào)查表明，絕經(jīng)后婦女AD的發(fā)病率較同齡男性高 1.53.1倍，原因與絕經(jīng)后婦女喪失了雌激素的保護(hù)作用有關(guān)11。接受雌激素治療的患者腦血流量增加,尤其是在海馬、海馬溝回、顳葉等與認(rèn)知功能相關(guān)的腦區(qū)12。大腦的海馬區(qū)與記憶和學(xué)習(xí)的關(guān)系密切，在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的雌激素受體(ER)。雌激素受體主

18、要在海馬錐體層神經(jīng)元中表達(dá)，雌激素受體陽性神經(jīng)元主要分布在CA3 和 CA4亞區(qū)，而在CA1 區(qū)較少。AD病理學(xué)上的一個(gè)重要特征為 CA1 區(qū)較 CA3區(qū)更易發(fā)生神經(jīng)退變，雌激素受體分布與AD病理變化部位的高度重合提示雌激素可能參與了AD的發(fā)病13。    中藥益智健腦顆粒是由淫羊藿、鎖陽、川斷、刺五加、柏仁、水蛭、田七等藥物組成的復(fù)方，適用于腎虛血瘀型的老年癡呆。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中藥益智健腦顆粒通過改善能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、構(gòu)成細(xì)胞骨架、增加激素等多途徑、多靶點(diǎn)治療AD?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 董克禮,宋 治.益智健腦顆粒治療早老性癡呆64例臨床觀察J.湖南

19、中醫(yī)雜志，1999；15(4):56.2 楊 聘,董克禮,曾望遠(yuǎn).益智健腦顆粒對快速老化鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶的改善作用J.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2005;14(7):6012.3 Lu PJ，Wulf G，Zhou XZ,et al.The prolyl isomerase Pinl restores the function of Alzheimers associated phosphorylated tau proteinJ.Nature,1999;399(6738)：7848.4 Goedert M.Alzheimers disease.Pinning down phosphorylate

20、d tauJ.Nature，1999;399(6738):73943.5 Vincent I，Jicha G，Rosado M,et al.Aberrant expression of mitotic cdc2/cyclin B1 kinase in degenerating neurons of Alzheimers disease brainJ.Neuroscience，1997;17 (10)：358898.6 Zhou XZ，Kops O，Werner A,et al.Pin1dependent prolyl isomerization regulates dephosphorylation of Cdc25C and tau proteinsJ.Mol Cell，2000;6(4)：87383.7 Colette Valentin，Henrik Birgens，Craescu CT.A phosphoglycerate kinase mutant(PGK Her lev,D285V) in a Danish patient with isolate chronic hemlytic ane