益舒軟肝丸對肝硬化大鼠TGFβ1及TIMP1表達的影響

1、益舒軟肝丸對肝硬化大鼠TGF1及TIMP1表達的影響         10-02-04 13:20:00     作者：王希君，陳超     編輯：studa20【摘要】  目的 研究益舒軟肝丸抗肝硬化的作用機理。方法 以CCl4復(fù)合因素法建立肝硬化模型，首先制備出肝硬化的實驗動物模型，造模結(jié)束后，連續(xù)灌胃給藥3個月。檢查ALT、AST，A/G、CHE；HA、LN、PNP、Hyp；TGF1和TIMP1。結(jié)果 與模型對照組大鼠比

2、，用藥組組織切片顯示匯管區(qū)有少量纖維組織增生，但未見假小葉結(jié)構(gòu)；肝功能指標(biāo)ALT、AST減少，A/G、CHE增加，肝功能有顯著好轉(zhuǎn)； HA、LN、PNP、Hyp水平顯著降低，肝纖維化程度降低；TGF1和TIMP1陽性表達減少。結(jié)論 益舒軟肝丸有明顯的抗肝硬化的作用，其作用機制可能與下調(diào)大鼠組織TGF1和TIMP1的表達，抑制細胞外基質(zhì)的合成和膠原增生、沉積有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  益舒軟肝丸；肝硬化；CCl4    ABSTRACT：Objective To investigate the effect and mechanism of Yishuruang

3、anwan(YS) on liver fibrosis induced by CCl4.Methods 80 Wistar rats were randomly divided into normal group model group and three YS groups (0.4, 0.8 and 1.6 g/kg). The model of liver fibrosis was induced by CCl4 and highfat diet in rats. After treatment with drug for 3 months, the histopathological

4、change of liver was observed, the levels of ALT, AST, HA, LN, PNP in serum, and the levels of A/G, CHE and Hyp in liver tissue were determined, and the expressions of  transforming growth factor beta (TGF1) and the tissue inhibitor of metalloproteinase1(TIMP1) was detected. Results Compared wit

5、h model group, YS could significantly alleviate the histopathological injury of liver induced by CCl4, decrease the levels of ALT, AST, HA, LN and PNP in serum, increase the levels of A/G, CHE, and reduce the content of Hyp in liver tissue. In addition, the expression of TGF1 and TIMP1 in YS groups

6、was markedly decreased as compared to model group (P<0.05). Conclusion YS has obvious protective effect on cirrhosis of liver and the mechanisms may be related with the decrease of TGF1 and TIMP1 expression and the inhibition of extracellular matrix synthesis.    KEY WORDS： Yishuru

7、anganwan；Cirrhosis；CCl4    各種病因引起肝細胞彌漫性炎性壞死、再生、誘發(fā)肝臟廣泛的纖維結(jié)締組織增生、小葉結(jié)構(gòu)破壞、假小葉形成，纖維間隔包繞再生的肝細胞而形成大、小結(jié)節(jié)，隧成為肝硬化。目前西醫(yī)治療肝硬化尚無特效療法，而中藥卻在治療上表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。益舒軟肝丸為民間驗方，由蠐螬、虻蟲、冬蟲夏草、水蛭、別甲、桃仁等中藥組成，在長期臨床實踐中顯示治療肝硬化作用明顯，臨床療效高，未見明顯毒副作用1。 本實驗研究益舒軟肝丸的作用及機制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。    1  材料與方法  

8、  1.1  實驗動物    Wistar雄性大鼠，清潔級，體質(zhì)量100±20g，共48只。購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院（動物許可證號Scxk(鄂)20040007）。    1.2  藥品與主要試劑    益舒軟肝丸(Yishuruanganwan,YS)由蠐螬、虻蟲、冬蟲夏草、水蛭、鱉甲、桃仁等中藥組成，粉成粉末過120目篩，由宜昌縣人民醫(yī)院藥劑科制備。用雙蒸水配成高（1.6g/kg體重）、中（0.8g/kg體重）、低（0.4g/kg體重）三個劑量組混懸液。金龍魚

9、大豆油由南海油脂工業(yè)有限公司生產(chǎn)。分析純四氯化碳，上海試劑總廠生產(chǎn)，批號：20040515 。膽固醇，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。羥脯氨酸（Hyp）試劑盒,南京建成生物工程研究所。血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）和 型前膠原（PNP）放射免疫分析試劑盒,北京北方生物技術(shù)研究所。冰醋酸，武漢江北化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，批號：20020829。兔抗鼠TIMP1多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫組化試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司。兔抗鼠TGF1多克隆抗體，美國SANTA CRUZ。二步法免疫組化檢測試劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型DAB試劑盒，北京中

10、杉金橋生物技術(shù)有限公司。    1.3  實驗動物分組及模型制備    動物常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗，隨機分為正常對照組（8只）和模型組。采用復(fù)合因素造模法24，模型組動物背部皮下注射40%CCl4油劑，首劑0.5ml/100g，以后每次0.3ml/100g，2次/周。同時采用高脂低蛋白食物：前2周，20%豬油+0.5%膽固醇+79.5%玉米面；后4周，0.5%膽固醇+99.5%玉米面。自由飲水。6周末隨機取2只檢測造模是否成功。造模成功后，改食普通飼料。模型組大鼠又隨機分為模型對照組（n=12只）、YS 0.4g/kg

11、組（n=10只）、0.8g/kg組（n=9只）、1.6g/kg組（n=9只）。模型對照組給予生理鹽水（1ml/只）灌服，治療組給予YS的混懸液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃12周，每周持續(xù)背部皮下注射CCl40.3ml/100g/次。12周末處死動物，留取血和肝組織標(biāo)本。取左中葉相同部位，10%福爾馬林溶液固定，制作病理石蠟切片。分別行HE、VG染色及TGF1和TIMP1免疫組化分析。    1.4  分析方法    光鏡下觀察肝組織標(biāo)本免疫組化結(jié)果。每張切片在顯微鏡下400倍隨機采集10個視野（避開邊緣效應(yīng)），并要求每個觀察視野

12、包含一個匯管區(qū)或一個中央靜脈,通過圖文分析系統(tǒng)測定TGF1和TIMP1免疫反應(yīng)產(chǎn)物的陽性表達總面積和平均灰度值。免疫組化產(chǎn)物染色越深，灰度值越小，抗原物質(zhì)的含量越高。    1.5  統(tǒng)計處理    采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理。先進行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗，方差齊性檢驗，組間比較采用方差分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異用單因素方差分析,多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)的比較采用q檢驗。P<0.05為有顯著性差異。     10-02-04 13:2

13、0:00     作者：王希君，陳超     編輯：studa20     2  結(jié)  果    2.1  肝功能和肝纖維化相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果    模型對照組ALT、AST血清水平異常升高(P<0.05或0.01)， A/G明顯降低, ALB、CHE降低，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)。用藥各組可明顯降低血清ALT、AST水平，提高CHE，與模型對

14、照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。用藥各組還可提高A/G、ALB降低AKP，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)檢測結(jié)果，見表2。模型對照組HA、LN、PNP明顯升高，與正常組比較差異有顯著性（P<0.01）；用藥各組可明顯降低HA、LN、PNP的水平，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中YS 0.8g/kg組降低HA、LN、PNP作用最明顯。由表可知，模型對照組Hyp含量最高，與正常組比差異有顯著性（P<0.01）；用藥各組可明顯降低Hyp含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。&

15、#160;   2.2  免疫組化結(jié)果    3  討  論    ECM合成和降解的主要調(diào)控因子是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)。基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)是一組鋅鈣依賴性內(nèi)肽酶，它通過降低膠原螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，改變底物的二級結(jié)構(gòu)，為其他蛋白酶作進一步降解創(chuàng)造條件。其功能主要是降解諸如膠原、蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)成分，在正常胚胎發(fā)育、器官發(fā)生、血管形成、創(chuàng)傷愈合過程以及關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、組織纖維化等多種疾病過程中起著重要作用。TIMPs是一組具有

16、抑制MMPs功能的活性多肽，它不但與MMP酶原以1:1形式相結(jié)合抑制其活化，而且能滅活活性酶，從而使MMPs失去降解功能，抑制ECM的降解5，6。    肝纖維化時TIMP1大量表達，使MMPs活性減少，造成肝損傷后增生的ECM成分尤其是、型膠原降解減少，沉積增多，而通過抑制TIMP1的表達，可有效抑制、型膠原的增生，從而延緩纖維化的發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示用藥組肝組織TIMP1的陽性總面積減少，平均灰度值增加。提示YS可能通過抑制TIMP1表達是促進ECM降解，拮抗肝硬化。    TGF（主要是TGF1）是迄今為止被認(rèn)為最強的致纖維化因

17、子，其作用機制有7： 能刺激肝臟成纖維細胞合成膠原；能抑制HSC膠原酶表達及促進TIMP的產(chǎn)生，減少ECM的降解，結(jié)果ECM凈生成增加；可刺激HSC合成PDGF，并增加PDGF受體的表達，從而促進HSC的增殖。本實驗結(jié)果顯示，用藥組肝組織TGF1的陽性總面積減少，平均灰度值增加。提示YS可能通過抑制TGF1的表達，使HSC的增殖活化得到抑制，減少膠原合成，增加ECM的降解，從而抗肝硬化。    益舒軟肝丸治療早期肝硬化大鼠的療效好，其機制可能有:抑制轉(zhuǎn)化生長因子1使肝星狀細胞的增殖活化得到抑制,減少膠原合成,增加細胞外基質(zhì)的降解;抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1表達，促進細胞外基質(zhì)降解，拮抗肝硬化?！緟⒖嘉墨I】  1王希君，張亮燕，張國愛，等.益舒軟肝丸對肝硬化逆轉(zhuǎn)作用的臨床療效觀察J.時珍國醫(yī)國藥，2006，12周忠信，王捷.肝硬化動