瘦素及其受體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及在血管形成中的作用

1、瘦素及其受體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及在血管形成中的作用【摘要】目的：研究瘦素（Leptin ,LEP）及其受體（Obgene receptor, Ob-R）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，探討LEP對(duì)女性生殖的影響。方法：采用SP免疫組織化學(xué)的方法 檢測(cè)LEP及其受體和VEGF在120例子宮內(nèi)膜（增殖期60例，分泌期60例）的表達(dá)。結(jié)果：LEP、Ob-R在人的子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)均 呈 陽(yáng)性表達(dá)；Ob R在分泌期子宮內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于增殖期，差異 有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（PV0.05） : VEGF在分泌期子宮內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于 增殖 期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV 0

2、05）;分泌期子宮內(nèi)膜中，Ob-R和VEGF表達(dá)存在顯著正相關(guān)性（r=0.288, PV 0.05）。結(jié)論：LEP及其受體可能通過(guò)VEGF在子宮內(nèi)膜血管形成中起作用，利于分泌期胚 胎著 床發(fā)育。【關(guān)鍵詞】瘦素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；免疫組織化學(xué)Abstract Objective: To explore the expressions of leptin , leptin（作者:單位:郵編:receptor(Ob-R) and vascular endothelial growth factor(VEGF)in women endometrium andthe e什ect of leptin on

3、 women reproduction. Methods:The expression of leptin and the leptin receptor and VEGF in endometrium from 120 normalmenstrual cycle woman (60 cases of proliferative pbase and 60 cases of secretivephase)were detected by immun ohistochemistry. Results: The express!on of leptin andOb-R were observed i

4、n both proliferative phase and secretive pbase of en dometrium.Compared with proliferative pbase,the expression of Ob-R was higher in secretive pbaseen dometrium. There was sig ni fica nt differe nce(P 0,05), The statistical analysisshowed that the positive rates of VEGF insecretive pbase was signif

5、icantly higher than that in the proliferative endometriumin the secretive pbase was significantly correlated with that of VEGF(r=0,288，P v0.05). Conclusion: Our results suggest that leptin and leptin receptor may play a bigrole in an gioge nesis by VEGF in En dometrium, which is adva ntageous to emb

6、ry onicimpla ntati on and developme nt in the secretory pbase.Key words Leptin ; Vascular endothelial growth factor; Immun ohistochemistry瘦素(Leptin , LEP)是肥胖基因的表達(dá)產(chǎn)物，是由脂肪組織及少pbase. The expressi onof lepti n receptor in量其他組織分泌的激素，也稱肥胖抑素，LEP通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。瘦素受體（Ob gene receptor, Ob-R）是由糖尿病基因編 碼的Ob-Rav

7、Ob-Rbx Ob-RCv Ob-Rdx OtnRe和Ob-Rf,其中Ob-Re為可 溶性受體，存在于血液循環(huán)中，作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其余5種異構(gòu)體 均為單 跨膜受體；Ob Rb為長(zhǎng)型受體，作為主要功能受體，其它均為短型受 體，廣泛存在于人體各種組織中，如下丘腦、心、腎、子宮內(nèi)膜等。LEP與受體結(jié)合后通過(guò)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與機(jī) 體多種功能,調(diào)節(jié)攝食、能量代謝、生長(zhǎng)、免疫過(guò)程、促進(jìn)生殖，參與腫瘤形成等。factor, VEGF）是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)微靜脈、小靜脈通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，細(xì) 胞質(zhì)鈣聚集以及誘導(dǎo)新生血管形成等作用。本研究通過(guò)檢測(cè)

8、Ob-R和VEGF在正常子宮內(nèi)膜增殖期和分泌期的表達(dá)，探討Ob-R和VEGF在子宮內(nèi)膜血管形成中的作用01對(duì)象與方法1.1對(duì)象 選擇120例月經(jīng)周期規(guī)律的生育年齡婦女的子宮內(nèi)膜，其 中增殖期60例，分泌中期60例（排卵后68天，即著床窗口期）。120例婦女年齡2737歲，平均年齡30歲，3個(gè)月內(nèi)未用過(guò)任何激 素。1 2試劑 兔抗人瘦素多克隆抗體Leptin（BA-1231）x兔抗人Ob R多克 隆單鏈跨膜糖蛋白。已知的OthR有6種異構(gòu)體，分別命名為:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthLEPvLEPv抗體（BA-1233）、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)

9、于武漢博士德公司，鼠抗人VEGF-165單克隆抗體購(gòu)于福州邁新公司。1 3免疫組化染色方法按SP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，所用抗體均為即用型抗體，染色時(shí)均需用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行微波修復(fù)抗原，PBS代替一抗做陰性對(duì)照，蘇木素復(fù)染。1 4結(jié)果判定LEP、Ob-R和VEGF蛋白均為胞漿著黃色，判斷陽(yáng) 性 采用半定量標(biāo)準(zhǔn)，以雙盲法進(jìn)行評(píng)分。每張切片隨機(jī)觀察代表意義的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取平均值作為結(jié)果。表達(dá)陰性和陽(yáng)性根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占面積，即兩者積分之和來(lái)判斷。染色強(qiáng)度分為：不染色為染色為中度染色為2,強(qiáng)度染色為3。染色面積分為：無(wú)細(xì)胞染 色為細(xì)胞染色為3。二

10、者積分之和為02為表達(dá)陰性，兩者積分之和2為 陽(yáng)性。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS10.0軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行X 2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，以a =0,05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2結(jié)果LEP及Ob-R陽(yáng)性著色以胞漿為主，少量間質(zhì)中亦可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。LEP在增殖期和分泌期內(nèi)膜中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)：OkR在分泌期子宮內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于增殖期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.05)o VEGF-165陽(yáng)性著色以胞漿為主，少量胞膜、間質(zhì)中亦 可見(jiàn)陽(yáng) 性表達(dá)。于分泌期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的表達(dá)高于增殖期,W個(gè)有0,輕度0, V25%細(xì)胞染色為1,25%50%細(xì)胞染色為2, 50%者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

11、V 0.05） O見(jiàn)表1。表1不同子宮內(nèi)膜組織中LEP ,Ob-R和VEGF的表達(dá)情況在60例分泌期子宮內(nèi)膜中，Ob-R和VEGF表達(dá)存在顯著正相關(guān)性（=0 288，PV 0.05）。3討論3.1 LEP及Ob R在正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)及意義LEP是肥胖(Ob)基因（位于人類染色體7q32）所編碼的一種分泌性蛋白質(zhì)，其主要功能 是調(diào)節(jié)能量平衡。OIR屬I類細(xì)胞因子受體家族，現(xiàn)至少發(fā)現(xiàn)有6種 異 構(gòu)體（isoform）。該家族共同的傳遞途徑為JAK-STAT,配體與受體 結(jié) 合后，激活JAK激酶，使JAK酪氨酸磷酸化后與磷酸化受體結(jié)合，進(jìn) 一步使下游胞漿蛋白STAT磷酸化，STAT磷酸化后轉(zhuǎn)入核內(nèi)

12、特定DNA結(jié)合區(qū)，啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄。最近的研究表明，LEP可促進(jìn)發(fā)育、啟 動(dòng)青春期、調(diào)節(jié)生殖功能1 0LEP在子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況報(bào)道不一致。Gonzalez RR等2應(yīng)用PT-PCRv Western blot和免疫組化方法檢測(cè)到中分泌期子宮內(nèi)膜LEP的表達(dá)。而After等3僅檢測(cè)到LEP蛋白在子宮內(nèi)膜表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)LEPmRNA的表達(dá)。After等報(bào)道Ob-R在有正常月經(jīng)周 期的表達(dá)為陰性或弱陽(yáng)性，而在低生育力及不孕患者分泌期中期和增殖期 晚期子宮內(nèi)膜呈弱陽(yáng)性或無(wú)表達(dá)。我們通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)分析顯 示，內(nèi)膜增殖期向分泌期演進(jìn)過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PV婦女子宮內(nèi)膜分泌期中期和增殖期

13、晚期表達(dá)最強(qiáng)，在分泌期早期LEP及Ob-R在子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)均有表達(dá);Ob R在子宮0.05) : LEP在分泌期子宮內(nèi)膜的表達(dá)也有增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(P0.05) 0 Ob-R在分泌中期(著床窗口期)內(nèi)膜表達(dá)高于增殖期,提示在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)呈周期性變化，與After等的報(bào)道相符。Ob R在分泌期子宮內(nèi)膜表達(dá)增強(qiáng)，可能參與分泌期螺旋小動(dòng)脈迂曲的形成，為孕卵著床和早期胚胎植入準(zhǔn)備條件。3.2 VEGF在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及意義VEGF是一種肝素結(jié)合性同源二聚體糖蛋白，分子量為3445kd,可特異地作用于血管內(nèi)皮 細(xì)胞,在不同條件下對(duì)血管生成起關(guān)鍵作用。VEGF的血管生成活性由其異構(gòu)

14、VEGF121x VEGF145、VEGF165、VEGF189禾口VEGF206,均系由VEGF基因轉(zhuǎn)錄時(shí)的不同拼接形成。VEGF異構(gòu)體VEGF-165屬VEGF主要的分子類型，可由各種正常和轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，且有增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性作用。在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，VEGF隨月經(jīng)周期發(fā)生相應(yīng)變化，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、增加微血管通透性，參與了胚胎發(fā)育、腫瘤生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)等病 理過(guò)程4 0 VEGFmRNA及蛋白主要局限在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及 血管周高的表達(dá)5。本實(shí)驗(yàn)研究表明，VEGF在正常子宮內(nèi)膜腺體 及間質(zhì)均 有表達(dá)，在分泌期內(nèi)膜表達(dá)高于增殖期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

15、V 0,05 ) 0最近研究發(fā)現(xiàn)，LEP是一種促血管生成因子，可促進(jìn)血管生成和增加 血管通透性。血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在Ob-R,是LEP的靶細(xì)胞之一。體和受體調(diào)節(jié)。目前已知有5種VEGF異構(gòu)體，包括LEP可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的OthR,使其磷酸化而激活 信號(hào)轉(zhuǎn) 錄因子STAT3,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促血管生成。最近Choi7研究發(fā)現(xiàn)Ob-R表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞表面，表達(dá)強(qiáng)度和微血管密 度 密切相關(guān)。Yamagishi等8報(bào)道，LEP可上調(diào)VEGF表達(dá)。Kitade等9通過(guò)大鼠試驗(yàn)表明，LEP的促血管生成作用及與VEGF的協(xié)同作用在非 酒精性肝硬化發(fā)展為肝纖維化及肝癌的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且L

16、EP通過(guò)促進(jìn)VEGF生成發(fā)揮血管生成作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)LEP、Ob-R和VEGF在子宮內(nèi)膜增殖期和分泌期的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在分泌期內(nèi)膜中Ob R與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，且隨著增殖期 向分泌期演 進(jìn)，Ob-R和VEGF均明顯表達(dá)增高。綜上所述，我們認(rèn)為L(zhǎng)EP及其受體以雙重表達(dá)的形式存在子宮內(nèi) 膜，有可能通過(guò)促進(jìn)VEGF分泌而發(fā)揮促血管生成作用，在分泌期作用 尤其明顯，利于胚胎著床。有關(guān)子宮內(nèi)膜中LEP、Ob-R與VEGF的具體 作用機(jī)制則有待于更進(jìn)一步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Chehab FF, Um ME, Lu R.Correction of the sterility defecti

17、n homozygous obese female mice by treatment with the humanrecombinant leptinJ,Nat Genet ,1996,12(3) : 318-320,2 Gonzalez RR , Caballero-Ca mpo P , Jas per M, et al.Le ptinand lept in receptor are expressed in the huma n en dometrium and en dometrial leptin secret! on is regulated by the huma n blast

18、ocystJ,JClin Endocrinol Metab,2000 , 85(12) : 4883-4888.3 After J, Muller-Schottle F, Classen-Linke I, et al.Theendometrium as a novel target for leptin : diferences in fertility andsubfertilityJ,Mol Hum Reprod , 2000, 6(7)： 595-601,4Hashimoto G , Inoki I , Fujii Y , et al,Matrix metalloprotein ases

19、 cleave conn ective tissue growth factor and reactivate angiogenic activityof vascular endothelial growth Factor-165J,J BiolChem,2002,277(39) : 36288-36295. Charnock-jones DS, Macpherson AM , Archer DF.Theeffect of progestins on vascular endothelial growth factor, oestroge n receptor andprogester on

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