表面TiO2鍍膜PVC氣管導管抗細菌污染的研究

1、中青年優(yōu)秀論文評獎表面TiO2鍍膜PVC氣管導管抗細菌污染的研究林財珠,林群,張劍榮,(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院麻醉科,福建福州,350004)中文摘要目的建立呼吸機相關性肺炎(VAP)家兔模型,研究新型氣管導管-TiO2/PVC(二氧化鈦/聚氯乙烯)氣管導管在抗細菌生物被膜(BF)形成中的作用, 以新西蘭白兔作為研究對象,探討在活體氣道環(huán)境下新型氣管導管的實際抗菌和殺菌性能,為后期的臨床實驗提供基本實驗參數(shù)及依據(jù)。方法將待用氣管導管內(nèi)表面以相同濃度細菌粘附后插入已麻醉的新西蘭白兔氣管內(nèi)并行機械通氣48小時,建立呼吸機相關性肺炎家兔模型。 健康新西蘭白兔32只，按插入氣管導管類型及光照處理的不

2、同方式隨機分為4組,每組8只。 C組（n=8），動物經(jīng)口插入標準PVC氣管導管，不經(jīng)光照處理；T組（n=8），動物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導管，不經(jīng)光照處理；C+uv組（n=8），動物經(jīng)口插入標準PVC氣管導管+氣管導管內(nèi)表面紫外光照射。T+uv組（n=8），動物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導管+氣管導管內(nèi)表面紫外光照射。機械通氣48小時后檢測氣管導管表面、動物氣道及肺組織細菌負荷量, 并采用電子掃描電鏡及激光共聚焦掃描電鏡檢測氣管導管表面細菌生物被膜,最后行肺組織病理檢查并量化評分,比較各組間上述檢測指標的差異。結(jié)果 T+uv組氣管導管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌與其他各組

3、比較明顯增高，存在顯著性差異（P0.01）。T+uv組動物呼吸道及肺組織的細菌負荷量與與其它各組動物比較有顯著的不同，表現(xiàn)為所有在肺組織及氣管內(nèi)定植的需氧菌、銅綠假單胞菌數(shù)量的顯著減少（P0.01）。電子掃描電鏡觀察T+uv組氣管導管表面形成的細菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）激光共聚焦掃描電鏡檢測,T+uv組氣管導管表面形成的細菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）.各組肺組織病理學評分，T+uv組動物肺組織與C組相比較，肺組織損傷評分明顯較低 (P0.01)。結(jié)論 呼吸機相關性肺炎家兔模型中,光活化TiO2/PVC氣管導管可明顯抑制其表面細菌生物被膜生成,有顯著的抗細

4、菌污染作用。關鍵詞 呼吸機相關性肺炎 生物被膜二氧化鈦 氣管導管 銅綠假單胞菌 A Study on PVC Endotracheal Tubes Coated with titanium dioxide against Bacterial ColonizationObjective To design a rabbit model of ventilator-associated pneumonia (VAP),and study the function of the new endotracheal tube(TiO2/PVC ETT) against bacterial biolm(B

5、F). To investigate the practical efficiency of the new ETT on antibiosis and sterilization in vivo by using New Zealand white rabbits ,and to provide the basic experimental parameters and evidences .Methods Paralysed rabbits were intubated with used ETTs With the same concentration of Microbial Adhe

6、sion,and were mechanically ventilated for 48 hours. A rabbit model of VAP was designed. Thirty-two major rabbits were divided into 4 groups according to the type of ETTs and different illumination ,with eight animals of every group. Eight rabbits were intubated with a standard ETT without illuminati

7、on (Group C); Eight rabbits were intubated with a TiO2/PVC ETT without illumination (Group T); Eight rabbits were intubated with a standard ETT With ultraviolet radiation (Group C+uv); Eight rabbits were intubated with a TiO2/PVC ETT with ultraviolet radiation (Group T+uv) .After 48 hours' mecha

8、nical ventilation we measured bacteria load on the surface of ETTs the animals air duct and lungs,and analyzed the bacterial biolm on the ETT with scanning electron microscopy and laser scanning confocal microscopy, and sent the lungs of the rabbits to the pathologist for microscopic study for quant

9、ization,then compared the difference of the indexes. Results The amount of alive bacterium including PA and other aerobes on the surface of ETTs in Group T+uv was significantly higher than others , there is significant difference between Group T+uv and other groups(P<0. 01). there is signifi

10、cant difference between Group T+uv and other groups(P<0. 01). As for bacteria load on the surface of ETTs the animals air duct and lungs,Group T+uv was significantly lower than others(P<0. 01) . thickness of BF on the surface of ETTs in Group T+uv is significantly less than other groups b

11、y scanning electron microscopy (P<0. 01). thickness of BF on the surface of ETTs in Group T+uv is significantly less than other groups by laser scanning confocal microscopy (P<0. 01). Comparing microscopic study for quantization among with Group C, thc score in Group T+uv is significantly lowe

12、r than other groups(P0.01).Conclusion In rabbit model of ventilation, TiO2/PVC ETT by photoactivtion can prevent bacterial biolm ,so it can decrease significantly bacterial colonization .Keywords ventilator associated pneumonia;bacterial biofilm;titanium dioxide;Pseudomonas aeruginosa;rabbits生物材料的應用

13、極大促進醫(yī)學診療技術飛速發(fā)展，同時也增加了細菌入侵宿主的途徑。由生物材料引起感染（biomaterial centered infections, BCI）的病例近年來逐年上升，僅美國每年就有超過三百萬件人工器官或部件植入人體，超過半數(shù)以上的植入物會引起人體感染，死亡率達5%60%，占院內(nèi)感染的45%1。其中，最具災難性的BCI當屬呼吸系統(tǒng)醫(yī)用級別聚氯乙烯（PVC）氣管導管長時間置入后發(fā)生的感染，特別是呼吸機相關肺炎(ventilator associated Pneumonia ,VAP)成為重癥監(jiān)護病房內(nèi)患者致死的主要原因，這在機械通氣患者中的發(fā)生率為18 %60 % ,病死率超過50 %

14、。導管內(nèi)的定植細菌會導致90%的機械通氣患者反復發(fā)生感染，通過這條途徑由某些病原體(如銅綠假單胞菌)所引起VAP的病死率甚至高達70%80 %2；對于那些氣管切開需長期置入PVC氣管套管的患者，細菌感染更是難以避免。據(jù)報道，生物材料作為異物不僅影響宿主的免疫機制，也影響誘發(fā)感染的最低細菌數(shù)量，主要原因是生物材料為游離細菌提供粘附的位點，促進了細菌粘附和細菌生物膜（Bacterial Biofilm, BF）的形成，BF中的細菌在形態(tài)結(jié)構、理化特性、抗生素抗性及對抗機體免疫防御等方面與普通浮游生長的細菌有顯著的不同： BF藻酸鹽層的屏障保護作用, 使抗菌藥物難以穿透被膜作用于深層細菌, 停用抗菌

15、藥物后, 這些存活的細菌就會游離釋放出來導致感染復發(fā)。 BF結(jié)構中不同位置的細菌生理狀態(tài)各不相同, 處于不同的代謝狀態(tài), 大多數(shù)抗菌藥物不能把休眠菌殺滅, 所以在任何時候都有一部分細菌得以存活。藻酸鹽能阻斷中性粒細胞的鈣通道, 使之無法表達與趨化性有關的受體, 使中性粒細胞的趨化性減弱, 吞噬作用減弱, 細菌從而逃逸機體的免疫攻擊。BF形成后, 細菌有足夠的時間來開啟耐藥基因, 內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)量大大高于浮游菌，這些抗菌藥物水解酶的增加進一步減低了進入膜內(nèi)抗菌藥物的含量3。這些因素使PVC氣管導管表面的BF成為BCI致病菌重要的、持續(xù)的來源，是導致BCI臨床治療極為困難的根本原因。因此有效控制和清

16、除PVC導管表面BF的形成將是防治以氣管導管為中心的BCI的關鍵。以往預防和治療以氣管導管為中心BCI的研究集中在細菌污染、侵入途徑、細菌毒力作用、病人抵抗力、抗菌藥物等方面，雖然取得了一定的效果，但仍然不能有效控制BF的形成。在BCI的發(fā)生和發(fā)展過程中，生物材料、細菌、宿主三大因素相互聯(lián)系，特別是生物材料表面是關鍵環(huán)節(jié)，引起B(yǎng)CI的初始動因就是細菌在生物材料表面的粘附，從本質(zhì)上講這是一個表面化學物理過程，與材料表面特性密切相關。近年國外學者開始嘗試使用各種辦法處理材料表面以期達到抗細菌粘附的目的。Jansen等人在表皮葡萄球菌對植入聚合物材料粘附的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著材料表面張力的增加，細菌的粘

17、附明顯減少4。Balazs等采用氧輝光放電對PVC氣管導管進行表面改性，增加其親水性，顯著抑制了銅綠假單胞菌在導管表面的粘附5。這表明以預防為主的PVC氣管導管的表面改性是解決這一問題的有效途徑，可能具有巨大的發(fā)展前景，隨著生物材料向分子生物學領域內(nèi)發(fā)展，設計出具有特定理化特性、抗細菌粘附及除菌能力的PVC氣管導管將有助于有效防治以氣管導管為中心的BCI。近年來TiO2（二氧化鈦）材料在化學中已經(jīng)被廣泛的研究。它化學性質(zhì)穩(wěn)定、無毒且具有良好的生物相容性。據(jù)大量文獻報道，TiO2作為納米薄膜可以很好地附著在陶瓷、玻璃、塑料等各種材料的表面，在光照或光照激發(fā)后表現(xiàn)出催化氧化性能和超親水性，這兩個性

18、質(zhì)已經(jīng)被成功地應用于有機污染物的光催化氧化消除和自清潔、超親水性涂層材料的制造6。本項目欲將這種技術引入醫(yī)學領域，研究TiO2光催化劑及其摻雜TiO2復合物在PVC導管表面的成膜方法并制備出表面具有抑菌和高親水性的納米薄膜，通過各種手段考察其對細菌生長和繁殖的抑制作用和殺滅作用，開發(fā)符合醫(yī)用標準的新型防感染氣管導管。這項技術的采用估計會使PVC導管表面產(chǎn)生如下功能：（1）形成高表面親水性，這會使具有憎水性的細菌難以在表面粘附和寄宿，而且由于TiO2隔絕了PVC與細菌的接觸，也使導管表面難以形成細菌生物膜；（2）獲得活性表面，當它受到光激發(fā)后可以產(chǎn)生電子和空穴，氧化破壞細菌的化學結(jié)構導致其喪失生

19、物活性，使細菌難以存活和繁殖。催化劑的這種作用在光照下非常顯著，在光照后有一定時間的記憶作用，所以在導管使用前后的光活化可以獲得更加顯著的破壞細菌生長的效果。通過賦予導管表面這樣的功能可使氣管導管達到抗細菌粘附和殺滅細菌的效果。結(jié)合前期研究，制備出符合實際要求的薄膜，在活體氣道環(huán)境下研究樣管的實際抗菌效果。以新西蘭大白兔作為研究對象，研究所制PVC導管材料在動物氣道內(nèi)的實際抗菌和殺菌性能。為后期的臨床實驗提供基本實驗參數(shù)，是本課題研究的意義所在。一材料與方法1 材料 儀器設備 PVC氣管導管 愛爾蘭Mallinckrodt MedicalTiO2/PVC氣管導管 福州大學光催化研究所醫(yī)用凈化工

20、作臺 蘇州凈化設備有限公司側(cè)光纖 南京春輝科技實業(yè)有限公司紫外光光源 Hamamatsu Co., JaPan HP-V24多功能生命體征監(jiān)測儀 美國惠普公司普通光學顯微鏡 日本OLYMPUS公司高壓滅菌鍋 北京凱宏偉業(yè)科技有限公司電子分析天平FC204 上海上平儀器有限公司DH-180H動物呼吸機 浙江醫(yī)學儀器實驗廠激光共聚焦掃描電鏡 Heidelberg, Germany電子掃描電鏡 JSM 6060LV SEM; JEOL Ltd., Tokyo, JaPan 藥品及試劑熒光試劑 LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial ViabilityKit , Molecula

21、r Probes,Inc.烏拉坦(20%氨基甲酸乙酯) 上海市曹楊第二中學化工廠批號9901156%HES溶液 北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司批號06101921力月西 江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司批號10980025萬可松 山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司批號20067458琥珀酰明膠注射液 沈陽貝朗制藥有限公司批號20040609磷酸鹽緩沖液 北京中杉金橋生物技術有限公司營養(yǎng)瓊脂 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司TiO2溶膠 福州大學光催化所氯化鈉 廣東西隴化工廠無水乙醇 廣東西隴化工廠1.3 實驗動物健康成年新西蘭白兔32只，體重kg,雌雄不拘。由上海松區(qū)江松聯(lián)實驗動物廠提供.2 方法2.1 氣管導管表面細

22、菌粘附 銅綠假單胞菌臨床分離株（PA）（分離自醫(yī)院ICU機械通氣患者氣管導管表面）。采用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中36 培養(yǎng), 每24 h 轉(zhuǎn)種1 次以保持PA菌活性。 接種動物前將處于對數(shù)生長期PA菌配成濃度為1×107 cfu/ ml菌液，然后將氣管導管內(nèi)腔充滿上述菌液，35孵育6 h 后棄菌液。平板計數(shù)法檢測細菌粘附量。經(jīng)上述細菌粘附處理的導管用于氣管插管。2.2 家兔機械通氣模型建立動物模型的建立: 所有兔實驗前禁食12h，不禁水。以22號靜脈留置針于兔耳緣靜脈穿刺置管后接5%GNS靜脈輸液.輸液速度10ml/kg/h, 20%烏拉坦1g/kg靜脈麻醉后固定兔四肢并使

23、之呈135度頭后仰位,經(jīng)口插入氣管導管(內(nèi)徑為3.0mm-3.5mm),連接監(jiān)護儀監(jiān)測,可見隨呼吸運動而規(guī)律出現(xiàn)的PetCO2,一般家兔氣管導管置入深度為11-15cm,固定氣管導管后接動物呼吸機行機械通氣.呼吸機參數(shù)設置:VT10-13ml/kg,f:30-40次/分,I:E比為1:2,吸入氧濃度60%.予咪唑安定并萬可松靜推使兔自主呼吸消失,再予萬可松及咪唑安定微量泵靜脈輸注維持麻醉. 通過電熱毯維持家兔直腸溫度。分離左頸動脈，20G留置針穿刺置管接換能器監(jiān)測平均動脈血壓(Mean Arterial Pressure，MAP)。使用多功能生命體征監(jiān)測儀（型號HP-V24，美國惠普公司）監(jiān)測

24、兔平均動脈壓(MAP)、心率、PetCO2、體溫、血氧飽和度(SPO2)并使之維持于正常范圍。動物分組 所有動物麻醉后明視下經(jīng)口插入經(jīng)細菌粘附處理的標準PVC氣管導管或者TiO2/PVC氣管導管于氣管內(nèi)，然后接動物呼吸機行機械通氣48 h。32只動物隨機分為4組： C組（n=8），動物經(jīng)口插入標準PVC氣管導管，不經(jīng)光照處理；T組（n=8），動物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導管，不經(jīng)光照處理； C+uv組（n=8），動物經(jīng)口插入標準PVC氣管導管+氣管導管內(nèi)表面紫外光照射。T+uv組（n=8），動物經(jīng)口插入TiO2/PVC氣管導管+氣管導管內(nèi)表面紫外光照射。 機械通氣期間對氣管導管內(nèi)壁行光催化

25、消毒的光照方法光照裝置對于C+uv組及T+uv組,氣管導管內(nèi)須引入紫外光照射,為了避免光照可能導致的氣道損傷，我們在通氣期間通過側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入紫外光，進行光催化滅菌；所使用的光纖前端設置一個保護套，避免光線直接向前照射。該法已經(jīng)向國家專利局申請發(fā)明專利。光纖直徑，這樣既可達到催化消毒目的，又能保證在光催化時行機械通氣，光照方法如圖1所示圖1 機械通氣期間對氣管導管內(nèi)壁行光催化消毒的光照裝置（1）紫外光波長：365nm；（2）光照強度：0.15 mw/cm2；（3）光照時間：氣管插管后每8h光照一次，每次30min；（4）光源：Lightningcure LC8 （Hamamatsu

26、 Co., JaPan）；（5）溫度3738；（6）管腔內(nèi)濕度100%。3 主要監(jiān)測指標：體外條件下導管內(nèi)表面細菌粘附量檢測： 導管內(nèi)表面體外條件下細菌粘附6小時后，橫斷切取1cm片段，置入5ml無菌生理鹽水中，超聲震蕩洗脫粘附菌，平板計數(shù)法測定導管內(nèi)表面細菌粘附量。細菌粘附量以cfu/cm來度量。機械通氣48小時后氣管導管表面、動物氣道及肺組織細菌負荷量檢測：機械通氣48h后，過量麻醉處死動物。無菌條件下移除氣管導管，導管外表面75%乙醇消毒，無菌刀片橫斷切取氣管導管距尖端、3cm處各2mm導管片段，分別置入5ml無菌生理鹽水中，超聲震蕩洗脫粘附菌，平板計數(shù)法檢測氣管導管內(nèi)表面細菌數(shù)量。細菌

27、粘附量以cfu/cm來度量。嚴格無菌條件下，切取氣管及每個右側(cè)肺葉并稱重，每個組織樣本取1g左右分別置于1 ml無菌生理鹽水中，冰浴下勻漿。取得的勻漿液立即送微生物檢驗室，采用標準細菌學技術對細菌進行定性、定量檢測。細菌粘附量以cfu/g組織來度量。3.1.3 氣管導管表面細菌生物被膜檢測為了評價導管內(nèi)表面細菌生物被膜細胞的生長活性，無菌條件下上述導管位置各橫斷切取2個2mm長度的導管片段。激光共聚焦掃描電鏡及電子掃描電鏡觀察。（1）激光共聚焦顯微鏡觀察導管表面細菌生物被膜熒光染液的配制：熒光染色劑為L7012 LIVE/DEAD BacLight TM Bacterial Viability

28、 Kit (MolecularProbes Inc) , 含有2 種染液SYTO9 和PI , 其中SYTO9使活細菌發(fā)出綠色熒光，而PI 則使死細菌發(fā)出紅色熒光，從而可以在鏡下區(qū)分活細菌和死細菌。熒光染液的配制按SYTO9PI蒸餾水= 1. 5l1. 5l1ml比例將3 種試劑加入同一離心管，振蕩混勻備用。每一導管片段用染液50l 。以上操作均在避光條件下進行。氣管導管表面細菌生物被膜熒光染色：每個導管位置各取1個導管片段。將導管片段用1ml 無菌蒸餾水輕輕洗滌，以去除未粘附的細菌,然后放在蓋玻片上，小心吸去蒸餾水，在導管環(huán)片段內(nèi)滴加50l 上述熒光染液, 立即置入暗盒內(nèi)，室溫孵育15 mi

29、n。 CLSM觀察氣管導管表面細菌生物膜: 將上述已完成熒光染色的導管片段進行Leica TCS-SP2 激光共聚焦掃描電鏡 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg, Germany)掃描并獲取圖像。觀察條件: 氬激光(514/488nm)，HeNe 激光(543nm)，物鏡×20，水鏡×63。每個生物膜標本由上(導管環(huán)背離玻片的一面) 向下(導管環(huán)和玻片相貼的一面) 逐層掃描, 步距為1m，所有數(shù)據(jù)都儲存到電腦硬盤上，通過隨機附帶的專業(yè)軟件處理,可以得到生物膜的斷層掃描圖像、生物膜的厚度。圖2 激光共聚焦顯微鏡獲取氣

30、管導管表面細菌生物被膜圖像示意圖（2）掃描電鏡觀察氣管導管表面細菌生物膜另外2個2mm長度的導管片段無菌PBS緩沖液沖洗后，新鮮配制的2.5%戊二醇PBS溶液中固定過夜。PBS緩沖液清洗，1%鋨酸固定4h，蒸餾水清洗，酒精逐級脫水，叔丁醇置換，冷凍干燥儀干燥，上臺噴金后高真空掃描電鏡 (JSM 6060LV SEM; JEOL Ltd., Tokyo, JaPan)檢測并拍照。肺組織病理學檢測無菌條件下切取左肺，真空抽氣技術下10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，蘇木精伊紅染色，光學顯微鏡觀察。肺組織損傷評分采用改良評分系統(tǒng)，由病理學專家盲法評分。肺組織損傷評分標準如下：1、充血：0分，無充

31、血；1分（輕度），肺毛細血管充血擴張；2分（中度），肺毛細血管充血擴張，部分肺泡內(nèi)充滿漿液或血液；3分（重度），肺毛細血管充血擴張，大部分肺泡腔內(nèi)充滿漿液或血液。2、水腫：0分，無水腫；1分（輕度），輕度肺間質(zhì)水腫；2分（中度），中度度肺間質(zhì)水腫，部分肺泡內(nèi)充滿漿液；3分（重度），嚴重的肺間質(zhì)水腫，大部分肺泡內(nèi)充滿大量漿液。3、炎癥細胞浸潤：0分，肺泡及肺間質(zhì)無炎癥細胞浸潤；1分（輕度），偶見中性粒細胞，個別肺泡及肺間質(zhì)見大單核細胞、淋巴細胞；2分（中度），大部分肺泡、肺間質(zhì)見中等數(shù)量的中性粒細胞、大單核細胞和淋巴細胞；3分（重度），大部分肺泡、肺間質(zhì)中見大量的中性粒細胞、大單核細胞和淋巴細胞

32、。4、細菌：0分，無可見細菌；1分（輕度），肺毛細血管充血擴張；2分（中度），吞噬細胞內(nèi)偶見細菌；3分（重度），肺泡、肺間質(zhì)、吞噬細胞內(nèi)見大量細菌。 4、統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件包進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差（- x ±s）表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用重復測量，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。表示差異有統(tǒng)計學意義，表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。結(jié)果1. 實驗動物一般情況各組家兔體重無統(tǒng)計學差異（P）（見表1） 表1 各組家兔一般情況比較（- x ±s）組別例數(shù)體重（kg） C8T8C+uv8T+uv82氣管插管前導管內(nèi)表面細菌粘附量C、T、C+uv、T+uv各組氣管導管內(nèi)表

33、面細菌數(shù)量分別為×106cfu/cm、×106cfu/cm、×106cfu/cmt和×106cfu/cm，組間差異無顯著性（P）,提示動物氣道內(nèi)細菌接種量各組無差異,見表2。表2 各組家兔氣管插管前導管內(nèi)表面細菌粘附量（- x ±s）組別例數(shù)細菌粘附量（cfu/cm） C8×106T8×106 C+uv8×106 T+uv8×1063.機械通氣48小時后氣管導管表面、動物氣道及肺組織細菌負荷量 在銅綠假單胞菌致機械通氣肺炎動物模型中，以PVCPVC氣管導管為對照，考察了有光照和無光照條件下溶膠凝膠法制備的

34、TiO2/PVC氣管導管對導管表面、動物氣道及肺組織中細菌負荷量的影響。在機械通氣期間通過側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入波長為365nm的紫外光（光照強度：0.15 mw/cm2，光照時間設定為氣管插管后每8h光照一次，每次30min），進行光催化滅菌。結(jié)果如圖3、4所示。圖3 機械通氣48小時氣管導管表面細菌負荷量（a） （b）圖4 機械通氣48小時后動物氣道及肺組織細菌負荷量(a)氣管 (b)肺組織可以看出，在紫外光光照照射下，機械通氣動物氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌均明顯少于標準PVC氣管導管（P0.01）（圖3）。為了排除TiO2/PVC氣管導

35、管的抗菌作用可能來自紫外光照射的直接的殺菌作用，我們同時也考察了紫外光光照射及無紫外光光照射對PVC氣管導管表面活菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，在紫外光光照射下及無紫外光光照射下，PVC氣管導管表面的活菌數(shù)量并無明顯的差別（P0.01）（圖4），可見上述紫外光光照條件對導管表面的粘附菌的活性幾乎沒有影響。因此可認為，TiO2/PVC氣管導管的抗菌性能與其光催化殺菌及抗細菌粘附性能密切相關。從圖4可以看出，T+uv組動物使用光活化TiO2/PVC氣管導管進行機械通氣48小時后，其呼吸道及肺組織的細菌負荷量與與其它各組動物比較有顯著的不同，表現(xiàn)為所有在肺組織及氣管內(nèi)定植的需氧菌、銅綠假單胞菌數(shù)量的顯著減

36、少（P0.01）。這可歸因于機械通氣期間光活化TiO2/PVC氣管導管的光催化抗菌作用減少了其表面的細菌定植，進而也減少了細菌從導管表面隨通氣氣流及各種氣道操作（如吸痰）向氣道內(nèi)、肺內(nèi)播散。這說明，機械通氣過程中使用光活化TiO2/PVC氣管導管將有助于減少機械通氣期間呼吸系統(tǒng)感染的風險。3.氣管導管表面細菌生物被膜檢測細菌生物被膜的形成是細菌為適應自然環(huán)境而采取的一種生存策略。生物被膜中的細菌無論其形態(tài)結(jié)構、生理、生化特性還是對抗菌藥物的敏感性都與普通浮游生長的細菌有顯著的不同，致病特性也不同，是造成難治性呼吸道感染性疾病的重要病因之一。我們采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）及掃描電鏡對PVC

37、導管表面形成的細菌生物被膜進行考察。圖5 機械通氣48小時后動物氣道內(nèi)PVC氣管導管內(nèi)表面細菌生物被膜形成圖5為CLSM下見到的機械通氣48小時后動物氣道內(nèi)PVC氣管導管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜結(jié)構圖片。可以看到細菌生物被膜中細菌分別被染成綠色和紅色，綠色的為活細菌，紅色的為死細菌；也有呈橙色或桔黃色，由死菌和活菌重疊造成。細胞之間有許多未被染色的黑暗區(qū)域，呈管狀或泡狀。細胞較密集, 可觀察到平滑的生物膜內(nèi)有大量細菌的存活。許多向外突起的細胞團塊被眾多暗黑的管道系統(tǒng)所分隔。PVC氣管導管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜管腔面及橫斷面掃描電鏡圖像。可以看到，導管表面被表面大量厚度不均的高密度細胞外基質(zhì)覆蓋，

38、其內(nèi)包裹的大量細菌團塊依稀可見。說明機械通氣48小時PVC氣管導管已經(jīng)可以形成成熟的細菌生物被膜。ab圖6 機械通氣48小時后電子掃描電鏡觀察氣管導管表面細菌生物被膜a. 細菌生物被膜橫斷面 b.氣管導管管細菌生物被膜管腔面。以PVC氣管導管為對照，在紫外光照射或無紫外光照射下，考察了紫外光活化對機械通氣期間TiO2/PVC氣管導管表面細菌生物被膜形成的影響。結(jié)果如圖7所示。ba圖7 機械通氣48小時后TiO2/PVC氣管導管表面細菌生物被膜形成 （a）無光照 （b）光照可以看到, C組機械通氣48h時PVC氣管導管表面生物膜均已經(jīng)形成相當厚度，細菌密集，有些成團塊狀，層層疊疊如層積云，如棉絮

39、樣，其活菌比例相對較高，管道較多且粗。而在T+uv組TiO2/PVC氣管導管表面生物膜則較薄，其內(nèi)細胞層中可見許多細菌團塊，其活菌比例相對較低。機械通氣48h時各組氣管導管表面細菌生物被膜厚度見圖8?？梢钥闯觯谧贤夤庹丈湎耇組TiO2/PVC氣管導管表面形成的細菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P）。這說明在光活化后，溶膠凝膠法制備的TiO2/PVC氣管導管具有較高的光催化抗菌活性，在機械通氣過程中可以顯著抑制導管表面細菌生物被膜的形成。 圖圖8.4肺組織病理學改變我們進一步考察其對肺組織病理學改變的影響。結(jié)果如圖9所示。圖9 銅綠假單胞菌氣管導管內(nèi)粘附+機械通氣48h后兔肺組織病理學改變

40、（HE染色 400） (a) C組（b）T+uv組ab從圖9中可以看出，銅綠假單胞菌氣管導管內(nèi)粘附及機械通氣48h后，C組使用PVC氣管導管的動物肺組織病理學發(fā)生明顯的炎癥性病理改變，表現(xiàn)為明顯的肺間質(zhì)、肺泡內(nèi)炎癥細胞浸潤。T+uv組采用光活化的TiO2/PVC氣管導管的動物肺組織炎癥改變則不明顯。圖10為各組肺組織病理學評分?？梢钥闯觯琓+uv組動物肺組織與其它各組相比較，肺組織損傷評分明顯較低 (P0.01)。上述結(jié)果說明在機械通氣過程中使用光活化的TiO2/PVC氣管導管可以減輕銅綠假單胞菌所致機械通氣肺炎模型動物肺部炎癥改變。這與光活化的TiO2/PVC氣管導管可以明顯減輕動物呼吸道及

41、肺組織的細菌負荷量密切相關。討論隨著醫(yī)療技術的飛速發(fā)展,呼吸機被越來越普遍地運用在臨床的各種原因?qū)е碌暮粑系K的患者身上,盡管呼吸機作為一種新興的治療手段拯救了許多患者的生命, 但在使用呼吸機的過程中引起的各種并發(fā)癥逐漸被人們所重視。呼吸機引起的并發(fā)癥很多, 其中最為嚴重的是呼吸機相關性肺炎，目前隨著新型生物材料應用的增多,細菌生物被膜( biofilm ,BF)與VAP的關系也開始受到重視7。氣管導管(endotracheal tube ,ETT)內(nèi)BF與VAP的關系也逐漸成為國內(nèi)外醫(yī)學、藥學及微生物學專家共同關注的問題。研究證實,BF的形成及播散入肺是VAP發(fā)病的重要發(fā)病機制。BF是細菌為

42、適應自然環(huán)境吸附于醫(yī)學生物材料或機體腔道黏膜表面,分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復合物(即所謂的“藻酸鹽”) ,并將其自身包繞其中而形成的一種融合的非結(jié)晶膜樣物。銅綠假單胞菌BF的形成過程主要分為三個階段:細菌首先粘附固著于固體物質(zhì)表面。吸引周圍同種細菌,使之聚集,增殖為小菌落。細菌分化形成外被胞外多糖基質(zhì)包繞的成熟BF。在上述過程中細菌發(fā)生一系列基因序列表達,完成從單體細胞向多細胞的演變 ,形成不同結(jié)構的BF8。通過激光共聚焦顯微鏡(scanning confocal lasermicroscoPy ,SCLM)以原位觀察活體BF時發(fā)現(xiàn),在BF內(nèi)有著相互交通的水通道(water c

43、hannels),細菌生存所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物可經(jīng)此進出BF深層. 研究認為,有45 %的正常人在睡眠中發(fā)生口咽分泌物的微量吸入,而在MV患者,尤其是伴有意識障礙、術后狀態(tài)、鼻飼者可高達90 %9,這是VAP的重要發(fā)病機制之一。在插入ETT后, ETT不僅不能預防這種誤吸,還削弱了咽下反射及上氣道的過濾防御機能 ,以BF形式寄殖于管腔內(nèi)的細菌能逃避機體免疫和抗生素的雙重殺滅作用,從而充當了病原菌的庇護所和放大器作用,成為VAP發(fā)病的一個重要病原來源.基于BF形成的階段特點,設計出具有特定理化特性、抗細菌粘附及除菌能力的PVC氣管導管將有助于有效防治以氣管導管為中心的BCI，具有巨大的發(fā)展前

44、景。針對BF 形成首先起始于粘附生物醫(yī)學材料表面的特性,國外已在開發(fā)新的生物聚合材料或采用特殊內(nèi)涂層以使細菌的粘附性減至最少10,另外還有應用可定期更換的雙層內(nèi)套管技術及抗生素飽和滲透處理導管技術報道 ,但都未見臨床應用11.涂銀ETT可顯著降低研究組動物ETT腔內(nèi)和肺組織內(nèi)細菌寄殖數(shù)量12。采用吸附有磺胺嘧啶銀和洗必泰的無菌濾紙粘附于內(nèi)壁的ETT進行研究,也取得了類似結(jié)果。英國的Adair等對比了霧化慶大霉素(80mg q8h)和靜脈注射頭孢菌素對ETT內(nèi)BF的影響 ,也取得了較理想的結(jié)果13,14。近年來TiO2材料在化學中已經(jīng)被廣泛的研究。它化學性質(zhì)穩(wěn)定、無毒且具有良好的生物相容性。據(jù)大

45、量文獻報道，TiO2作為納米薄膜可以很好地附著在陶瓷、玻璃、塑料等各種材料的表面，在光照或光照激發(fā)后表現(xiàn)出催化氧化性能和超親水性，這兩個性質(zhì)已經(jīng)被成功地應用于有機污染物的光催化氧化消毒（空氣凈化、污水處理和抑菌及殺菌）和自清潔、超親水性涂層材料的制造。這為改進PVC氣管抗菌性能提供了一條可行的解決思路。 前期分別采用溶膠凝膠法和懸漿提拉法制備出附著力強和光催化活性優(yōu)良的TiO2薄膜，前者稱之為TPP，后者稱之為PTP，研究證實PTP在預光照12h后（PTP-12h），表現(xiàn)最高抗菌活性，隨后趨于穩(wěn)定。TPP和PTP-12h兩種膜對不同細菌均表現(xiàn)出較強抗粘附作用，其中PTP-12h膜的性能更為優(yōu)良

46、。365nm紫外光照下，樣片對大腸桿菌殺滅能力按照強弱分為PTP-12h TPP PTP。PTP-12h在光照90分鐘后可將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌全部殺滅。根據(jù)此實驗結(jié)果,新型氣管導管采用PTP鍍膜,并以此建立機械通氣動物模型,研究此種氣管導管在活體內(nèi)的抗菌性能,以此考證此新型氣管導管在抑制細菌生物被膜形成過程中的作用,論證其抗菌效能。 實驗模型的建立中,應用紫外光用來催化TiO2薄膜的抗菌性能,考慮到紫外光對活體的可能損傷作用, 我們自制了側(cè)發(fā)光紫外光纖向?qū)Ч軆?nèi)引入紫外光，這樣的光催化方式使得紫外光只能從光纖側(cè)孔對導管內(nèi)層TiO2薄膜進行催化,光纖前端設置一個保護套，避免光線直接向前照射而

47、引起氣道粘膜的損傷。 在動物機械通氣前,待用氣管導管全部采用相同濃度的臨床菌株處理,并用平板計數(shù)法檢測氣管導管細菌粘附量,各組氣管導管內(nèi)表面細菌數(shù)量比較無統(tǒng)計學意義,提示動物氣道內(nèi)細菌接種量各組無差異。經(jīng)這一系列處理的氣管導管用于建立肺炎動物模型,保證了組間比較的均衡性。有學者通過對BF致病菌進行細菌類型鑒定，分離出的微生物包括上呼吸道寄殖菌叢、金黃色葡萄球菌、腸道菌群、銅綠假單孢菌、其他G-菌株及白念珠菌屬等,多數(shù)呈G+球菌和G-桿菌的混合生長,其中30%為院內(nèi)獲得性肺炎的常見致病菌 ,可呈彌漫性或局灶性分布,每厘米管長的細菌密度可高達106cfu15 。考慮到呼吸道以這些致病菌為主,本研究

48、以氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量為研究指標,既涵蓋了本研究中預先粘附的細菌,又包括動物體內(nèi)原來的上呼吸道寄殖菌叢,探討TiO2/PVC氣管導管抑制細菌的作用.結(jié)果顯示, 在紫外光光照照射下，機械通氣動物氣道內(nèi)的TiO2/PVC氣管導管表面的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量菌均明顯少于標準PVCPVC氣管導管（P0.01），同樣也顯著少于PVC氣管導管表面活菌數(shù)量（P0.01）,證明了新型氣管導管的抑菌性能。 生物被膜具有高粘附性，尤其是長期留置導管者。雖然電鏡觀察樣本在制作中使占生物被膜空間65% 95%的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等高水化成分被壓縮

49、，但仍可看到生物被膜的特殊分層立體結(jié)構，其基底層基質(zhì)的存在，支持先有呼吸道分泌物在管腔的粘附，再有細菌寄殖的發(fā)現(xiàn)16。ETT內(nèi)腔外壁的表面特性可影響到積聚物的吸附、累積和演變。生產(chǎn)工藝過程所致的表面MurP hy ,s小孔的存在、不規(guī)則設計及不良光滑度均提供了BF 形成的最初病灶核心。聚氯乙烯塑料有利于細菌的粘附 ,Portex 管的不透光層也有利于積聚物的累積17。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細菌和ETT內(nèi)壁并無直接的接觸 ,而上呼吸道分泌物在管腔表面的粘附先于細菌的寄殖。細菌依靠范德華力、疏水力等與基底層結(jié)合 ,隨后分泌大量的胞外多糖聚合物 ,隨著粘附細菌的增多及生長分化 ,就形成了一層主要由多糖聚合物包

50、繞細菌并含有其它復雜成分的BF18。細菌在管壁上團狀叢生并突出于管腔，容易受到氣體及流體力學作用，從而被逐入下呼吸道成為致病因子.本實驗中,T+uv組的生物被膜厚度明顯小于C組,也小于其他兩組,提示了光活化TiO2/PVC氣管導管可明顯抑制其表面細菌生物被膜生成。 Inglis發(fā)現(xiàn)在長時間機械通氣模型中,BF 主要位于通氣機“Y” 型接頭靠近患者側(cè)的環(huán)路和ETT內(nèi) ,呈不同厚度的非均勻分布 ,積聚最多的部位在管子的下端 ,厚度可達 0. 5mm 或以上 ,可呈波浪狀、 蘑菇狀、 柱狀 ,部分管子的尖端斜面處或臨近區(qū)域BF缺失隨著插管時間延長 ,BF 呈特殊的分層排列 ,細菌間由多糖蛋白連接。細

51、菌在 BF 中的植入方式從形態(tài)上分為表面或表層的浮游細菌散在包埋于多糖外被內(nèi) ,或呈團狀叢生、部分突出于內(nèi)腔的細菌團19。Koerner用SCLM 發(fā)現(xiàn) , ETT腔壁上最早的非結(jié)晶層在插管后11小時既已形成。插管24小時內(nèi)即可發(fā)生細菌的管腔內(nèi)定殖且逐漸增加 ,48小時細菌生物被膜基本形成,5 天后進入相對平衡狀態(tài)20.本實驗研究結(jié)果與之相符,機械通氣48小時后用SCLM可觀察到動物氣道內(nèi)PVC氣管導管內(nèi)表面完整的菌斑生物膜。可以看到細菌生物被膜中細菌分別被染成綠色和紅色，綠色的為活細菌，紅色的為死細菌；也有呈橙色或桔黃色，由死菌和活菌重疊造成。細胞之間有許多未被染色的黑暗區(qū)域，呈管狀或泡狀。

52、細胞較密集, 可觀察到平滑的生物被膜內(nèi)有大量細菌的存活。許多向外突起的細胞團塊被眾多暗黑的管道系統(tǒng)所分隔?？梢钥吹? C組機械通氣48h時PVC氣管導管表面生物膜均已經(jīng)形成相當厚度，細菌密集，有些成團塊狀，層層疊疊如層積云，如棉絮樣，其活菌比例相對較高，管道較多且粗。而在T+uv組TiO2/PVC氣管導管表面生物膜則較薄，其內(nèi)細胞層中可見許多細菌團塊，其活菌比例相對較低。機械通氣48h時各組氣管導管表面細菌生物被膜厚度見圖8?？梢钥闯?，在紫外光照射下T組TiO2/PVC氣管導管表面形成的細菌生物膜平均厚度明顯小于其它各組（P0.01）。這說明在光活化后，溶膠凝膠法制備的TiO2/PVC氣管導管

53、具有較高的光催化抗菌活性，在機械通氣過程中可以顯著抑制導管表面細菌生物被膜的形成。上述結(jié)果說明在機械通氣過程中使用光活化的TiO2/PVC氣管導管可以減輕銅綠假單胞菌所致機械通氣肺炎模型動物肺部炎癥改變。這與光活化的TiO2/PVC氣管導管可以明顯減輕動物呼吸道及肺組織的細菌負荷量密切相關。對于本實驗中各組動物肺組織的炎癥變化,采用光學顯微鏡觀察,肺組織損傷評分采用改良評分系統(tǒng)，由病理學專家盲法評分。以此方法將肺組織病理變化量化,有利于肺組織損傷的評價及比較.T+uv組動物肺組織與C組相比較，肺組織損傷評分明顯較低 (P0.01),有力地證實了T+uv組的肺損傷程度遠較其他組小。結(jié)論1.機械通

54、氣期間,在365nm的紫外光照下，TiO2/PVC氣管導管表面粘附的銅綠假單胞菌及所有需氧菌的活菌數(shù)量明顯減少。2/PVC氣管導管可明顯抑制其表面細菌生物被膜生成。3.機械通氣期間,光活化TiO2/PVC氣管導管比普通PVC氣管導管肺部炎癥改變明顯減輕。參考文獻1 Lorenzo Berra, M.D., Lorenzo De Marchi, M.D., et al . Endotracheal Tubes Coated with Antiseptics Decrease Bacterial Colonization of the Ventilator Circuits, Lungs J .

55、Anesthesiology 2004; 100:14461456.2 Kozlow JH, Berenholtz SM, Garrett E, Dorman T, Pronovost PJ: Epidemiol-ogy and impact of aspiration pneumonia in patients undergoing surgery in Maryland, 19992000. Crit Care Med 2003; 31:19301937.3 武慶平,姚尚龍,袁世熒.呼吸機相關性肺炎動物模型的建立 J. 中國危重病急救醫(yī)學, 2005, 8: 501-502.4 Prince AS: Biolms, antimicrobial re