整理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一

1、整理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一噴施小分子有機(jī)物對(duì)小油菜生長(zhǎng)發(fā)育和養(yǎng)分吸收的影響一、土壤樣品的采集和處理1、供試土壤的選擇 供試土壤：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院德州實(shí)驗(yàn)站禹城實(shí)驗(yàn)基地多年勻地試驗(yàn)耕層土壤，質(zhì)地為輕壤。 主養(yǎng)分含量：全氮 0. 65 g / kg、速效磷（ P2 O5 ）16. 29 mg / kg、速效鉀（ K2 O）90. 15 mg / kg、有機(jī)質(zhì) 9. 43g / kg、PH 7. 98。1.1土壤全氮測(cè)定：半微量開氏法【主要儀器】消煮爐；50ml或100ml開氏瓶；半微量定氮蒸餾裝置；150ml錐形瓶；5ml或10ml半微量滴定管。試劑：（1）硫酸。 =1.84g·ml-1，化學(xué)純；（2

2、）10mol·L-1NaOH溶液。 稱取NaOH（AR）400g（工業(yè)用固體NaOH，稱420g），于硬質(zhì)玻璃燒杯中，加蒸餾400ml溶解，不斷攪拌，以防止燒杯底角固結(jié)，冷卻后倒入塑料試劑瓶，加塞，防止吸收空氣中的CO2，放置幾天待Na2CO3沉降后，將清液虹吸入盛有約160ml無CO2的水中，并以去CO2的蒸餾水定容1L加蓋橡皮塞（濃度約為40% W/V）。（3）甲基紅溴甲酚綠混合指示劑。即0.099g溴甲酚綠和0.066g甲基紅于瑪瑙研缽中，加少量95%酒精，研磨至指示劑完全溶解，用95%乙醇定容100ml。此指示劑變色范圍pH 4.4(紅)5.4（藍(lán)），貯存期不超過2個(gè)月。（4

3、）20g·L-1 H2BO3指示劑注1。稱取硼酸（分析純）20g溶于約950ml水中，加熱攪動(dòng)直至H3BO3溶解，冷卻后，加入混合指示劑20ml混勻（每10mlH3BO3加入2ml指示劑），并用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)至紫紅色（pH約4.5），加水稀釋至1L混勻，貯存在塑料瓶中備用。宜現(xiàn)配。（5）混合催化劑。K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4（化學(xué)純）、10g CuSO4 ·5H2O（化學(xué)純）、和1g Se粉混合研磨，通過80號(hào)篩充分混勻（注意戴口罩），貯于具塞棕色磨口瓶中。消煮時(shí)每毫升H2SO4加0.37g混合加速劑。（6）高錳酸鉀溶液。25g高錳

4、酸鉀（分析純）溶于500ml無離子水，貯于棕色瓶中。（7）1:1硫酸（化學(xué)純、無氮、=1.84g·ml-1）。硫酸與等體積水混合。（8）還原鐵粉。磨細(xì)通過孔徑0.15mm（100號(hào)）篩。（9）辛醇。（10）0.01 mol·L-1（1/2H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)液。量取H2SO4（化學(xué)純、無氮、=1.84g·ml-1）2.83ml，加水稀釋至5000ml，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿或硼砂標(biāo)定之，得0.02 mol·L-1（1/2H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)溶液。將0.02 mol·L-1（1/2H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)溶液用水準(zhǔn)確稀釋一倍。標(biāo)定：平行3份，空白3份。稱取1.9068g硼

5、砂注2（Na2B4O7·10H2O），精確至0.0001g，加水溶解后稀釋至500ml，得0.0500mol/L硼砂標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取20.00ml硼砂標(biāo)準(zhǔn)溶液置于150ml錐形瓶中，加1滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液由藍(lán)色變?yōu)樽霞t色為終點(diǎn)。同時(shí)做空白試驗(yàn)。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度按下式計(jì)算：式中：C鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；C1硼砂標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（0.02000），mol/L；V1硼砂標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；V2鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，ml；V0空白試驗(yàn)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；【測(cè)定步驟】（1）稱取通過孔徑0.149mm篩（即100目篩） 注3 風(fēng)干土樣1.0000g（含

6、氮約1mg）注4，同時(shí)測(cè)定土樣水分含量，最后換算成烘干樣計(jì)算結(jié)果。（2）土樣消煮注5不包括硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的消煮：將土樣小心移入干燥的消煮管底部，加少量無離子水（0.51ml）濕潤土樣后注6，加入加速劑1.85g和濃硫酸5ml，搖勻，將開氏瓶?jī)A斜置于變溫電爐上，最初宜用低溫，待瓶?jī)?nèi)無泡沫發(fā)生（約10min15min），提高溫度（375，4h）使消煮的土液保持微沸，加熱的部位不超過瓶中的液面，以防瓶壁溫度過高而使銨鹽受熱分解，導(dǎo)致氮素?fù)p失。消煮的溫度以硫酸蒸氣在瓶頸上部1/3處冷凝回流為宜。待消煮液和土粒全部變?yōu)榛野咨詭ЬG色后，再繼續(xù)消煮1h。（個(gè)別土樣如果分解困難，消煮液轉(zhuǎn)清亮的過程較慢，必須

7、延長(zhǎng)半小時(shí)左右。）消煮完畢，取下凱氏瓶冷卻，準(zhǔn)備蒸餾。在消煮土樣的同時(shí)，做兩份空白測(cè)定，除不加土樣外，其他操作皆與測(cè)定土樣相同。包括硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的消煮：將土樣送入干燥的開氏瓶（或消煮管）底部，加高錳酸鉀溶液1ml，搖動(dòng)開氏瓶，緩緩加入1:1硫酸2 ml，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)開氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通過長(zhǎng)頸漏斗將0.5g(±0.01g)還原鐵粉送入開氏瓶底部，瓶口蓋上小漏斗，轉(zhuǎn)動(dòng)開氏瓶，使鐵粉與酸接觸，待劇烈反應(yīng)停止時(shí)（約5min），將開氏瓶置于電爐上緩緩加熱45min（瓶?jī)?nèi)土液應(yīng)保持微沸，以不引起大量水分丟失為宜，205）。?；?，待開氏瓶冷卻后，通過長(zhǎng)頸漏斗加加速劑2g和濃

8、硫酸5ml，搖勻。按上述的步驟，消煮至土液全部變?yōu)辄S綠色，再繼續(xù)消煮1h。消煮完畢，冷卻待蒸餾注7。在消煮土樣的同時(shí)，做兩份空白測(cè)定。（3）氨的蒸餾蒸餾前先檢查蒸餾裝置是否漏氣，并通過水的餾出液將管道洗凈。待消煮液冷卻后，用少量無離子水將消煮液定量地全部轉(zhuǎn)入蒸餾器內(nèi)，并用水洗滌開氏瓶45次（總用水量不超過3035ml）。若用半自動(dòng)式自動(dòng)定氮儀，不需要轉(zhuǎn)移，可直接將消煮管放入定氮儀中蒸餾。在150ml錐形瓶中，加入5ml H2BO3指示劑混合液 注8，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上34cm處注9。然后向蒸餾室內(nèi)緩緩加入20 ml 10 mol·L-1NaOH溶液，通入蒸汽蒸餾，待

9、餾出液體積約50ml時(shí)，即蒸餾完畢。用少量已調(diào)節(jié)pH至 4.5的水洗滌冷凝管的末端。用滴定餾出液由藍(lán)綠色至剛變?yōu)榧t色。記錄所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）?？瞻诇y(cè)定所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，一般不得超過0.4ml?！窘Y(jié)果計(jì)算】土壤全N量（g·kg-1）=式中：V滴定試液時(shí)所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V0滴定空白時(shí)所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；c0.01 mol·L-1（1/2H2SO4）或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；m風(fēng)干土質(zhì)量；K土壤水分系數(shù)。兩次平行測(cè)定結(jié)果允許差為0.005%。2.2土壤中速效磷的測(cè)定（鉬銻比色法）操作步驟：1.稱取通過18號(hào)篩(孔徑為1mm)的風(fēng)干土樣5g(精確到0.

10、01g)于200ml三角瓶中，準(zhǔn)確加入0.5mol/L碳酸氫鈉溶液100ml,再加一小角勺無磷活性碳，塞緊瓶塞，在振蕩機(jī)上振蕩30分鐘(振蕩機(jī)速率為每分鐘150180次)，立即用無磷濾紙干過濾，濾液承接于100ml三角瓶中。最初78ml濾液棄去。2.吸取濾液10ml(含磷量高時(shí)吸取2.55ml；同時(shí)應(yīng)補(bǔ)加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液至10ml)于50ml量瓶中，加硫酸鉬銻抗混合顯色劑5ml充分搖勻，排出二氧化碳后加水定容至刻度，再充分搖勻。3.30分鐘后，在分光光度計(jì)上比色(波長(zhǎng)660nm)，比色時(shí)須同時(shí)做空白測(cè)定。4. 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取5mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5ml于

11、50ml容量瓶中，每一容量瓶即為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L磷，再逐個(gè)加入0.5mol/L碳酸氫鈉10ml和硫酸一鉬銻抗混合顯色劑5ml，然后同待測(cè)液一樣進(jìn)行比色。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果計(jì)算：土壤速效Pmg/kg=比色液mg/L×定容體積/W×分取倍數(shù)式中：比色液mg/L從工作曲線上查得的比色液磷的mg/L數(shù)；W稱取土樣重量(g)。分取倍數(shù)100/10土壤速效磷(P)mg/kg        等級(jí)5       

12、60;                                低510                 

13、;    中10                       高2.3 土壤速效鉀的測(cè)定：醋酸銨火焰光度計(jì)法主要儀器：1/1000天平、振蕩機(jī)、火焰光度計(jì)、三角瓶(250ml,100ml)、漏斗(60ml)、濾紙、坐標(biāo)紙、角匙、吸耳球、移液管(50ml)試劑：(1)中性1.0mol/LNH4OAc溶液，稱77.08g NH4OAc溶于近1升水中，用稀HOAc

14、或NH4OH調(diào)節(jié)至pH=7.0 , 用水定容至1升。(2)K標(biāo)準(zhǔn)溶液  稱取0.1907克KCl溶于1mol/L NH4OAc溶液中，完全溶解后用1mol/LNH4OAc溶液定容至1升，即為含100mg/L K的NH4OAc溶液。用時(shí)分別吸取此100mg/L K標(biāo)準(zhǔn)液0，2，5，10，20，40ml放入100ml容量瓶中，用1mol/L NH4OAc定容，即得0，2，5，10，20，40mg/L K標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。操作步驟：稱取風(fēng)干土樣(1mm孔徑)5.××g于150ml三角瓶中，加1mol/LNH4OAc溶液50.0ml(土液比為1：10)，用橡皮塞塞緊，在202

15、5下振蕩30分鐘用干濾紙過濾，濾液與鉀標(biāo)準(zhǔn)系列溶液一起在火焰光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)定，在方格紙上繪制成曲線，根據(jù)待測(cè)液的讀數(shù)值查出相對(duì)應(yīng)的mg/L數(shù)，并計(jì)算出土壤中速效鉀的含量。結(jié)果計(jì)算：土壤速效鉀(K)mg/kg=待測(cè)液mg/L×加入浸提劑毫升數(shù)/風(fēng)干土重。2.4 土壤有機(jī)質(zhì)的測(cè)定：重鉻酸鉀容量法儀器試劑：1.主要儀器:分析天平(0.0001g)、硬質(zhì)試管、長(zhǎng)條臘光紙、油浴鍋 、鐵絲籠(消煮時(shí)插試管用)、溫度計(jì)(0360   )、滴定管(25ml)、吸管(10ml)、三角瓶(250ml)、小漏斗、量筒(100ml)、角匙、滴定臺(tái)、吸水紙、滴瓶(50ml)、試管夾、吸耳球

16、、試劑瓶(500ml)。2.試劑:(1)0.136mol/LK2Cr2O7H2SO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取分析純重鉻酸鉀(K2Cr2O7)40g溶于500ml蒸餾水中，冷卻后稀釋至1L，然后緩慢加入比重為1.84的濃硫酸(H2SO4)1000ml，并不斷攪拌，每加入200ml時(shí)，應(yīng)放置1020分鐘使溶液冷卻后，再加入第二份濃硫酸(H2SO4)。加酸完畢，待冷后存于試劑瓶中備用。(2)0.2mol/LFeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確稱取分析純硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)56g或硫酸亞鐵銨Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O80g，溶解于蒸餾水中，加3mol/L的硫酸(H2SO4)

17、60ml，然后加水稀釋至1L，此溶液的標(biāo)準(zhǔn)濃度，可以用0.0167mol/L重鉻酸鉀(K2Cr2O7)標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定。(3)鄰啡羅啉指示劑。稱取分析純鄰啡羅啉1.485g，化學(xué)純硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)0.695g，溶于100ml蒸餾水中，貯于棕色滴瓶中(此指示劑以臨用時(shí)配制為好)。測(cè)定步驟：1.在分析天平上準(zhǔn)確稱取通過60目篩子(0.25mm)的土壤樣品0.10.5g(精確到0.0001g)，用長(zhǎng)條臘光紙把稱取的樣品全部倒入干的硬質(zhì)試管中，用移液管緩緩準(zhǔn)確加入0.136mol/L重鉻酸鉀硫酸(K2Cr2O7-H2SO4)溶液10ml，(在加入約3ml時(shí)，搖動(dòng)試管，以使土壤分散

18、)，然后在試管口加一小漏斗。2.預(yù)先將液體石蠟油或植物油浴鍋加熱至185190，將試管放入鐵絲籠中，然后將鐵絲籠放入油浴鍋中加熱，放入后溫度應(yīng)控制在170180，待試管中液體沸騰發(fā)生氣泡時(shí)開始計(jì)時(shí)，煮沸5分鐘，取出試管，稍冷，擦凈試管外部油液。（充分搖勻后加濃硫酸60mL，緩緩搖動(dòng)1min，加一彎頸小漏斗，置于沸水中保溫30min，每隔約5min搖動(dòng)一次。取出冷卻至室溫，用水沖洗小漏斗，洗液承接于三角瓶中。）3.冷卻后，將試管內(nèi)容物小心仔細(xì)地全部洗入250ml的三角瓶中，使瓶?jī)?nèi)總體積在6070ml,保持其中硫酸濃度為11.5mol/l,此時(shí)溶液的顏色應(yīng)為橙黃色或淡黃色。然后加鄰啡羅啉指示劑34

19、滴，用0.2mol/l的標(biāo)準(zhǔn)硫酸亞鐵(FeSO4)溶液滴定，溶液由黃色經(jīng)過綠色、淡綠色突變?yōu)樽丶t色即為終點(diǎn)。4.在測(cè)定樣品的同時(shí)必須做兩個(gè)空白試驗(yàn)，取其平均值?？捎檬⑸按鏄悠?，其他過程同上。結(jié)果計(jì)算：在本反應(yīng)中，有機(jī)質(zhì)氧化率平均為90%，所以氧化校正常數(shù)為10090，即為1.1。有機(jī)質(zhì)中碳的含量為58%，故58g碳約等于100g有機(jī)質(zhì)，1g碳約等于1.724g有機(jī)質(zhì)。由前面的兩個(gè)反應(yīng)式可知：1mol的K2Cr2O7可氧化32mol的C，滴定1molK2Cr2O7，可消耗6mol FeSO4，則消耗1molFeSO4即氧化了32×16C=14C=3計(jì)算公式：有機(jī)質(zhì)g/kg= (V0

20、-V)N×0.003×1.724×1.1)樣品重×1000式中：V0滴定空白液時(shí)所用去的硫酸亞鐵毫升數(shù)。V滴定樣品液時(shí)所用去的硫酸亞鐵毫升數(shù)。N標(biāo)準(zhǔn)硫酸亞鐵的濃度。mol/L2、 選取的作物品種 供試作物：小油菜 品種：京華一號(hào)。3、 選取的肥料 供試小分子有機(jī)物：山梨醇（ 分析純，分子量 182. 17）、 葡萄糖酸鈉（ 分析純，分子量218. 14）、 甘氨酸（ 分析純，分子量 75. 07）。4、 底肥的施用： 底肥的處理：試驗(yàn)播種前，將過 2 mm 篩風(fēng)干土壤與肥料混勻，裝入內(nèi)徑為 24 cm、高 15 cm 的塑料盆中，每盆裝風(fēng)干土 3. 25

21、 kg。 所用肥料：尿素（ N 46. 2% ）、磷酸二銨（18-46 -0）、硫酸鉀（ K2 O 50% ），施肥量為每千克土施 N 0. 25 g、P2 O5 0. 15 g、K2 O 0. 15 g。 施用方法：磷、鉀肥一次性施入，氮肥施入 60% ，其余 40% 在出苗后第 35 天追施。5.選取的噴施階段（噴施次數(shù)、噴施濃度、噴施過程注意事項(xiàng)不要互相影響） 噴施樣品： 2013 年 6 月 29號(hào)播種出苗后 1 周定苗，每盆保留長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯苗 4 株。 噴施階段：小油菜三葉期 噴施次數(shù)：，每次20 mL / 盆，每隔7天噴施一次，共噴施4次。 噴施注意事項(xiàng)：噴施時(shí)用塑料薄膜遮蓋盆中

22、土壤和相鄰盆，避免噴施液進(jìn)入土壤和噴到相鄰盆中的小油菜苗。其他管理按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施和方式。 收獲時(shí)間：2013年8月13 日二、樣品采集及測(cè)定樣品收集：收獲時(shí)、新鮮植株樣品帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定項(xiàng)目：植株硝酸鹽、可溶性糖及可溶性蛋白 株高用直尺測(cè)量植株，從露出土壤根部至頂端的距離； 葉長(zhǎng) 用直尺測(cè)量植株頂部倒數(shù)第 3 片展開葉葉尖至葉基距離；葉寬用直尺測(cè)量倒數(shù)第 3 片葉最寬部分距離；小油菜葉面積 = 葉長(zhǎng) x 葉寬 x 0. 7517。測(cè)定方法：小油菜植株體 NO3 含量采用水楊酸法測(cè)定，可溶性糖的測(cè)定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法測(cè)定 ，葉片 SPAD 值的測(cè)定采

23、用 SPAD-502儀測(cè)定，磷、鉀含量的測(cè)定采用 H2 SO4 和 H2 O2 濕法消煮，用微量開氏法測(cè)定氮、釩鉬黃比色法測(cè)定磷、火焰光度法測(cè)定鉀。2. 可溶性總糖的測(cè)定（蒽酮比色法）儀器和試劑：1 .儀器 （ 1) 分光光度計(jì) (2 ）電子頂載天平 (3 ）三角瓶： 50m1 X 1 （ 4 ）大試管： 9 支 （ 5) 試管架，試管夾 （ 6 ）漏斗，漏斗架 （ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2 （ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1 （ 9 ）水浴鍋 2 .試劑 （ 1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液： l00ug/ml (2 ）濃硫酸 (3) 蒽酮試劑 :0.2g 蒽酮溶于

24、 100 ml 濃 H2SO4 中當(dāng)日配制使用。 3 .材料 小麥分蘗節(jié)。 操作步驟 :1 .葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取 7 支大試管，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液： 管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸餾水（ ml ） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量（ ug ） 0 10 20 30 40 60 80 在每支試管中立即加入蒽酮試劑 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸 l0min 取出，用流水冷

25、卻，室溫放置 10min ，在 620 nm 波長(zhǎng)下比色。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量（ ug) 作橫坐標(biāo)，以吸光值作縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2 .植物樣品中可溶性糖的提取 將小麥分蘗節(jié)剪碎至 2mm 以下，準(zhǔn)確稱取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加蓋煮沸 10min ，冷卻后過濾，濾液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。吸取提取液 2m1 ，置另一 50m1 容量瓶中，以蒸餾水稀釋定容，搖勻測(cè)定。 3 .測(cè)定 吸取 lml 已稀釋的提取液于大試管中，加入 4.Oml 蒽酮試劑，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。比色波長(zhǎng) 620nm ，記錄吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖的含量（ ug ）。 計(jì)算公式：3.測(cè)定蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)G-250染色法材料、試劑與器具（一）試劑1、染色液：取考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀釋至1升。該染色液可保存數(shù)月，若不加水可長(zhǎng)期保存，用前稀釋。2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白