鈣拮抗劑對(duì)大鼠心肌缺血再灌注早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1表達(dá)的影響

1、鈣拮抗劑對(duì)大鼠心肌缺血再灌注早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1表達(dá)的影響         08-11-29 14:15:00     編輯：studa20                    作者：李海青，石剛剛，高分飛，賈強(qiáng)用【摘要】  目的：研究鈣拮抗劑(維拉帕米、地爾硫芭卓和硝苯地平)

2、對(duì)大鼠心肌缺血再灌注(I/R)芭卓早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(Egr-1)表達(dá)的影響。方法：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組、二甲基亞砜組、維拉帕米組、地爾硫芭卓組、硝苯地平組。Western blot法測(cè)定Egr-1蛋白表達(dá)水平的變化；RT-PCR法測(cè)定Egr-1 mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果：與假手術(shù)組比，I/R組Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與I/R組比，維拉帕米組、地爾硫芭卓組和硝苯地平組Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論：維拉帕米、地爾硫芭卓和硝苯地平均可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1 mRNA

3、的過度表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  鈣拮抗劑；缺血再灌注；早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1AbstractObjective: To study the effects of calcium antagonist(verapamil、diltiazem and nifedipine)on early growth response gene-1(Egr-1)expression in rats after myocardial ischemia-reperfusion(I/R). Methods: Rats were randomly assigned into Sham、I/R、DMSO、verapa

4、mil、diltiazem、nifedipine groups. The expression levels of Egr-1 protein and mRNA were examined by Western blot and RT-PCR, respectively. Results: Compared with sham group, Egr-1 protein and mRNA of I/R group overexpressed(P<0.05). The expression levels of Egr-1 of verapamil、diltiazem、nifedipine g

5、roups significantly decreased, compared with I/R group(P<0.05). Conclusion: Verapamil、diltiazem and nifedipine can inhibit the overexpression of Egr-1 protein and mRNA in  rats caused by I/R.Key Wordscalcium atagonist; ischemia-reperfusion; early growth response gene-1    細(xì)胞內(nèi)鈣

6、超載是缺血再灌注(I/R)損傷的主要病理機(jī)制之一，而作為構(gòu)成I/R損傷分子通路共同分子基礎(chǔ)的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Egr-11，其與細(xì)胞內(nèi)Ca2+之間存在非常緊密的聯(lián)系，Ca2+可通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑直接或間接影響Egr-1的表達(dá)。眾所周知，鈣拮抗劑防治心肌I/R損傷的主要機(jī)制是阻斷心肌細(xì)胞膜鈣通道，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(Ca2+)i，拮抗鈣超載。而我們的前期工作也證實(shí)了F2和維拉帕米均能通過阻斷心肌細(xì)胞膜鈣通道，降低心肌細(xì)胞(Ca2+)i，防止鈣超載拮抗心肌I/R Egr-1的異常表達(dá)2,3。因此我們提出假設(shè)：具有鈣拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表達(dá)的效應(yīng)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，進(jìn)一步探討鈣拮抗劑

7、的共性作用，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠心肌I/R損傷模型，運(yùn)用3種經(jīng)典的鈣拮抗劑，觀察其對(duì)Egr-1 mRNA及Egr-1蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討其分子生物學(xué)機(jī)制提供有力的依據(jù)。1  材料與方法1.1  動(dòng)物    SD大鼠廣州第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供許可證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015,2006B008；SPF雌雄不拘，體質(zhì)量250350g。1.2  儀器與試劑    BL-420E信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(四川成都泰盟科技有限公司，中國(guó))；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；乳化分析儀(IKA公

8、司，德國(guó))；聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)儀器、凝膠成像分析系統(tǒng)、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、全自動(dòng)PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD公司，美國(guó))；壓力蒸汽滅菌器(嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司，中國(guó))；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，中國(guó))；二甲基亞砜(DMSO，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))；兔抗大鼠Egr-1多克隆抗體(Santa Crutz公司，美國(guó))；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記2抗IgG(博士德公司,中國(guó))；硝酸纖維素膜、Trizol試劑、PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó))；Egr-1引物和-actin引物(上海華美生物工程公司

9、，中國(guó))；第一鏈cDNA合成試劑盒(MBI Fermentas公司,立陶宛)；維拉帕米(恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó))；硝苯地平和地爾硫芭卓(Sigma公司，美國(guó))。1.3  心肌I/R模型的建立及分組    大鼠稱重,烏拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉，分離氣管后立即行正壓人工呼吸(頻率60次/min，流量2mL/100g)。從左側(cè)第3、4肋間打開胸腔，暴露心臟，剪破心包膜，用2個(gè)小拉鉤撐開并向下按壓胸廓使心臟暴露于胸腔外，在肺動(dòng)脈圓錐左緣平左心耳下緣2mm冠狀動(dòng)脈處進(jìn)針，用5/0絲線穿過心肌層。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈時(shí)連同直徑2mm的塑料膠管一起結(jié)扎造成心肌缺血6

10、0min，然后解除結(jié)扎再灌注180min。    大鼠隨機(jī)分為I/R組(術(shù)前5min予NS 1mL/kg，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，60min后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流，再灌注180min)；DMSO組(術(shù)前5min改NS為DMSO，手術(shù)操作同I/R組)；維拉帕米組(術(shù)前5min予維拉帕米0.5mg/kg,用NS稀釋，同樣按照1mL/kg給予)；地爾硫芭卓組(術(shù)前5min予地爾硫芭卓0.8mg/kg,用NS稀釋成1mL/kg給予)；硝苯地平組(術(shù)前5min予硝苯地平0.2mg/kg，用NS稀釋成1mL/kg給予)；假手術(shù)組(術(shù)前5min予NS 1mL/kg，手術(shù)時(shí)冠狀動(dòng)

11、脈前降支穿線但不結(jié)扎，持續(xù)觀察240min)。1.4  Egr-1蛋白測(cè)定    取100mg心肌組織塊，用干凈的剪刀將組織于冰上快速剪碎，加入預(yù)冷的裂解液20mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，體積分?jǐn)?shù)1的TritonX-100，1mmol/L乙二胺四乙酸；pH 7.41.5mL與5L的Protease inhibitor cocktail ，用乳化分散儀將心肌組織于冰上充分勻漿，每一標(biāo)本勻漿30s冰上靜置30s，共勻漿3次，勻漿至無(wú)明顯組織顆粒為止，冰上靜置10min，2655g，離心10min(4)，棄上清液，加

12、入裂解液200L，冰上靜置裂解2h， 期間不斷渦旋使其充分裂解， 然后15294g，離心20min(4)，吸取部分上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，部分上清液與5×上樣緩沖液41混合，煮沸5min。配制分離膠與濃縮膠，然后每一泳道加60g蛋白樣品，電泳(125V，80min)，轉(zhuǎn)膜(350mA，60min)。封閉液封閉1h，加入1200 Egr-1抗體稀釋液，4過夜，洗膜3次，每次10min，加11500的2抗稀釋液室溫孵育2h，洗膜3次，每次10min，滴11 Ecl化學(xué)發(fā)光試劑于膜上，反應(yīng)1min，壓片1min，曝光1min，將膠片進(jìn)行顯影、定影。1.5  Egr-1

13、 mRNA的測(cè)定    取-30冰箱保存的100mg心肌組織塊，轉(zhuǎn)移到5mL離心管中，每管加入1mL Trizol試劑，用干凈的剪刀將組織于冰上快速剪碎，用乳化分散儀將心肌組織于冰上充分勻漿，每一標(biāo)本勻漿30s冰上靜置30s，共勻漿3次，勻漿至無(wú)明顯組織顆粒為止。然后轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，室溫靜置5min，每管加氯仿0.3mL，振搖15s，室溫靜置3min，10621g,離心10min(4)，吸取上層水相，移至另一新的離心管中，加預(yù)冷的等體積異丙醇，-30冰箱中靜置30min，15294g,離心10min(4)，棄上清液，加體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇1mL，搖振，充分洗滌沉淀，7600g,離心5min(4)，棄上清液，超凈臺(tái)中干燥2min，沉淀重懸于RNase-free水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及A260/A280比值。提取的總RNA凍存于-70冰箱。采用第一鏈cDNA合