Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分離與純化

1、01 血清球蛋白的分離與純化【目的要求】1.掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理和基本過程。2.熟悉鹽析、離心、層析、電泳、比色等生物化學(xué)基本技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的綜合應(yīng)用。4.學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)和制定分離純化蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方案、技術(shù)路線和質(zhì)量監(jiān)控和保證措施?！緦?shí)驗(yàn)原理】不同蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)各有不同，利用這些不同便可獲得分離純化。血清蛋白有300多種,可粗略分成清、球蛋白兩大類，球蛋白只是球蛋白中的一個(gè)亞類。欲用常規(guī)方法獲得，可先用半飽和硫酸銨從血清中鹽析出球蛋白，接著用葡聚糖凝膠G25（Sephadex25）脫去球蛋白中的鹽分（硫酸銨），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纖維素陰離子交換柱，便可直接

2、從脫鹽的球蛋白溶液中分離純化出球蛋白，其反應(yīng)機(jī)理如下：被柱層析交換結(jié)合的球蛋白和球蛋白，可通過增加洗脫液的離子強(qiáng)度或降低洗脫的pH值（也可兩者同時(shí)改變），使其分部洗脫下來而被純化。純化前后的球蛋白可用電泳方法進(jìn)行比較鑒定?！緦?shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】一、器材1.離心機(jī)2.層析柱(直徑約1-1.2cm,長約30cm)3.電泳儀二、試劑1.飽和(NH4)2SO4溶液 稱固體(NH4)2SO4（分析純）850g置于1,000ml蒸餾水中，在7080水中攪拌溶解，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和(NH4)2SO4液。2.葡聚糖凝膠G25按每100ml凝膠床需干的葡聚糖凝膠G25 25g，置于錐形瓶中，

3、按每克干膠加入蒸餾水約30ml，輕輕搖勻并于沸水浴中加熱1小時(shí)，或于室溫浸泡24小時(shí)，攪拌后稍靜置，傾去上清細(xì)粒，用蒸餾水漂洗。3.0.075mol/L pH6.3磷酸緩沖液(pH6.3 PBS)0.0175mol/L NaH2PO4液秤取NaH2PO4 2H2O 2.730g溶于100ml蒸餾水中，轉(zhuǎn)入1000cc容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度即成。0.0175mol/L Na2HPO液秤取Na2HPO4·12H2O 6.269g，如配制即成。取液77.5ml、液22.5ml，混勻后即成0.075mol/L pH6.3的磷酸緩沖液。4.20%磺基水楊酸。5.Nesseler試劑6.血

4、清醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗(yàn)的全套儀器及試劑。7.DEAE（二乙氨基乙基）纖維素處理 按100ml柱床體積稱取DEAE纖維素14g，每克加0.5mol HCl 15ml攪拌，放置30分鐘（HCl處理時(shí)間不可太長，否則DEAE纖維素變質(zhì)），加約10倍量的蒸餾水?dāng)噭颍胖闷?，待纖維素下沉后，傾棄含細(xì)微懸浮物的上層液，如此反復(fù)23次，沉淀30分鐘，虹吸吸去上清或布氏漏斗抽濾，如此水洗至清液pH>4為止。加等體積1mol NaOH，使最終濃度約為0.5mol NaOH，攪拌后，放置30分鐘，以虹吸吸去上層液體，同上用蒸餾水反復(fù)洗至pH<7為止，虹吸吸去上層液體，然后加入0.0175mol/L

5、pH6.3磷酸緩沖液使之平衡，置4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。【?shí)驗(yàn)操作】1.(NH4)2SO4鹽析 取血清2.0ml，緩慢滴入飽和（NH4）2SO4溶液2.0ml，邊加邊攪，混勻后于室溫中放置10分鐘，然后3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，并小心傾去上清液。沉淀加0.0175mol/L pH6.3磷酸緩沖液1ml，使之溶解，作為純化球蛋白用。2.凝膠層析脫鹽葡聚糖糖凝膠G25層析柱的準(zhǔn)備：取層析柱垂直夾于架上，關(guān)緊下端出口，加蒸餾水少許，緩慢加入膨脹處理過的凝膠懸液，待底部凝膠沉積到12cm時(shí)，再打開出口，并用玻璃棒插入到凝膠床表面下，輕輕攪動(dòng)，繼續(xù)加入凝膠，待凝膠下沉至1015cm高（防止凝膠分層和柱內(nèi)混有氣泡

6、，使表面平整并蓋一尼龍布或塑料片）。用0.0175mol/L pH6.3磷酸緩沖液流洗平衡后，即可使用。上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面（注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進(jìn)入凝膠床）。關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢加到凝膠床表面上（注意不要將凝膠粒沖起或破壞凝膠床表面的平整）。開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床后再加少量的緩沖液，如此重復(fù)三次，以洗凈柱內(nèi)壁上的樣品溶液，然后可加入適量的緩沖液洗脫。加樣開始后應(yīng)立即收集洗脫液，流速約0.5ml/分鐘，每2分鐘收集一管。洗脫液中蛋白質(zhì)與NH+4的檢查：取比色皿2個(gè)（一個(gè)為黑色背底，另一個(gè)為白色）

7、，按洗脫液的管號(hào)順序分別取1滴，滴于比色皿中，前者各加20%磺基水楊酸2滴，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出，由此可估計(jì)蛋白質(zhì)在洗脫各管中的分布及濃度。于另一比色皿中各加入Nesseler試劑1滴，以觀察NH+4出現(xiàn)的情況(若有棕黃色，即碘化雙汞銨NH2·Hg2I2生成，說明有NH+4的存在)。合并球蛋白含量高的各管，用DEAE纖維素陰離子交換柱純化。純化前后取樣鑒定。3.DEAE纖維素陰離子交換層析 經(jīng)處理再生后的EDAE纖維素，按上法裝柱，用0.0175mol/L pH6.3磷酸緩沖液平衡，將脫鹽后的球蛋白溶液加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫，分部收集，檢查洗脫

8、蛋白質(zhì)的分布情況（裝柱、上樣、洗脫、收集及蛋白質(zhì)檢查等操作步驟有關(guān)注意事項(xiàng)同上）。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】一、純度鑒定采用醋纖膜電泳法。樣品三個(gè)：（1）血清。（2）葡聚糖凝膠G25脫鹽球蛋白液。（3）DEAE纖維素陰離子交換柱純化的球蛋白液（由于此溶液濃度較低，應(yīng)多次點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣時(shí)待干后再點(diǎn)，共約點(diǎn)1520l）。電泳及染色：方法同醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白實(shí)驗(yàn)，比較樣品的電泳結(jié)果。二、定量檢測1.用雙縮脲法定量血清總蛋白，鹽析出的球蛋白總量，計(jì)算A/G值。還可測定脫鹽前后球蛋白總量，計(jì)算球蛋白鹽析收得率，觀察脫鹽對(duì)球膽白收率究竟有無影響。2.用Lowry,s法定量DEAE柱各分部收集管中的球蛋白含量

9、，制作球蛋白洗脫圖，并討論其意義。3.可對(duì)兩種定量方法做平行對(duì)照測定，討論這兩種方法適用價(jià)值【注意事項(xiàng)】1.勿使鹽析中發(fā)生共沉。為此加飽和(NH4)2SO4時(shí)每滴不宜大，速度不宜快，邊加邊攪動(dòng)。2.嚴(yán)格按柱層析的裝柱、上樣的技術(shù)要求，裝好G-25柱，上好待脫鹽的鹽析球蛋白液；裝好DEAE柱，上好待分離純化球蛋白的脫鹽球蛋白液。3.脫鹽流速不宜過快，一般0.5ml/M為宜。4.pH6.3是DEAE離子交換層析柱從樣品球蛋白中截留和球蛋白，放行球蛋白，致使球蛋白得以分離純化的關(guān)鍵pH，必須調(diào)配準(zhǔn)確。5.Nesseler試劑是檢查球蛋白鹽析液通過G-25柱的流出液中有沒有NH4+，何時(shí)才有NH4+的試劑，事關(guān)脫鹽效果。該試劑的酸堿度對(duì)檢察的準(zhǔn)確性和靈敏度甚為重要。為此，可用該試劑滴定20ml、 mol濃度的標(biāo)準(zhǔn)HCl，從其耗量（即滴定值）評(píng)價(jià)其酸堿度。具有最適酸堿度的Nesseler試劑，對(duì)20ml標(biāo)準(zhǔn)HCl的耗量在1111.5ml。若耗量超出11.5ml說明該試劑偏酸，顯色偏淺，測試將出現(xiàn)假陰性；如消耗低于9.5ml，試劑偏堿，顯色偏深，乃至出現(xiàn)紅色沉淀，測試結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。若遇上述情況可用無Na2CO3的10%的NaOH溶液或molHCl進(jìn)行調(diào)試。6.應(yīng)選擇快速、靈敏定性檢測