實時熒光定量PCR原理和實驗

1、實時熒光定量PCR原理和實驗陳云地作者單位：200030 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems    無論是對遺傳病(如地中海貧血和血友病、傳染病(如肝炎和艾滋病或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實時熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。這是DN

2、A定量技術(shù)的一次飛躍。    根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I 熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實驗設(shè)計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。    

3、定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實驗和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調(diào)。當(dāng)然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能出現(xiàn)的問題。1 為什么終點定量不準(zhǔn)確？    我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來

4、越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動很大（圖1）。 圖1 同一個樣本重復(fù)96次PCR的擴增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。   

5、0;對于絕大多數(shù)實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等，需要測定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過PCR擴增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。2 為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？    CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實驗中可以直觀地看到，盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，C

6、T值減小1個循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。    這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡便，以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EXnRS,也就是說第n次PCR循環(huán)時的熒光信號強度(Rn等于背景信號強度(RB 加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS 與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n = CT時，則有RT=RB+XO(1+EXCTRS。兩邊取對數(shù)，得log(RT -RB = logX0 + CTlog(1+ Ex + log

7、Rs。整理此式，CTlog(1+ Ex = - logX0 + log(RT -RB logRs。所以對于每一個特定的PCR反應(yīng)來說，EX、RT、RB和RS都是常數(shù)，所以CT值與log X0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數(shù)(X0的對數(shù)成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點定量則比較粗放。    如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR的效率(即Ex為100%，從上式推算出定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和CT值的最佳范圍。3 怎樣確定CT值？    實驗操

8、作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時所對應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）。“基線上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴增曲線的交點所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定義是從第3個循環(huán)起到CT值前3個循環(huán)止，其終點要根據(jù)每次實驗的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個循環(huán)之間。早于3個循環(huán)時，熒光信號很弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開始增強，超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來處理。圖2 CT值和閾值顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基

9、線，基線取決于實驗的質(zhì)量，CT值是一個完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。4 熒光信號和定量數(shù)據(jù)的歸一化    雖然大多數(shù)定量PCR儀都會自動扣除本底，但是仍然需要注意熒光信號強度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實驗數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過在反應(yīng)體系

10、中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以后，即Rn = R / RROX，就可以在同樣的起點上進(jìn)行比較和各種計算。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖3）。圖3 ROX熒光校正（左）和不校正（右）對實驗數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號再扣除本底，就得到DRn：DRn = Rn,樣本 - Rn,空白。DRn是最后構(gòu)建PCR實時擴增曲線的縱坐標(biāo)。    無論絕對定量還是相對定量

11、，在得到實驗結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實驗操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/L或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。    這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿?。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法為：DNA樣本 / DNAIPC，或者DC

12、T = CT, 樣本 - CT, IPC。因為CT值與起始DNA拷貝數(shù)的對數(shù)是反比關(guān)系，可以證明，這兩種計算方法在數(shù)學(xué)上是等價的。    為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進(jìn)行定量測定，所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(Internal Positive Control，IPC。要進(jìn)行IPC歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測能力，最好是4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。5 污染的預(yù)防和熱啟動    為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施

13、有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase和熱啟動。UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活，95°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50°C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。    普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR試劑的過程中、正式PCR開始前就會完成少量PCR擴增，增加了背景，影響定量精度。而金牌Taq酶經(jīng)過特殊修飾，常溫下其

14、活性部位被封閉，沒有活性；只有經(jīng)過95 °C 10 min的熱啟動以后，封閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實驗和陰性、陽性對照    定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實驗，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)68次，以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。    如果作絕對定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個點以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的DNA樣本，可以自己制備，也可以購買商品化的試劑盒。其PCR反

15、應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時定量。    陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操作上可能出現(xiàn)的問題。如果實驗中設(shè)立了IPC，則IPC既可以用來校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽性對照的作用。7 TaqMan探針技術(shù)原理    TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。   

16、; 在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter, R，如FAM、VIC等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號（圖4）。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強

17、度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。圖4 TaqMan探針的熒光信號產(chǎn)生機制TaqMan探針根據(jù)其3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder修飾基團(tuán)（圖5），可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想

18、的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqMan MGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。圖5 TaqMan MGB探針8 SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引

19、物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。圖6 SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對PCR引物設(shè)計的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。9 定量PCR儀簡介    目前在國內(nèi)使用得比較多的熒光實時定量PCR儀有美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，AB

20、I的7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型為例作簡單介紹。    7000型熒光定量PCR儀設(shè)計滿足臨床檢驗、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實驗的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機配置的定量PCR引物和探針設(shè)計軟件Primer Express非常有用，因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設(shè)計定量PCR所需的TaqMan探針。    7000型有實時動態(tài)(Real-Time和終點讀板(Plate Read兩種運行模式。實時動態(tài)模式用于定量，測定DNA或RNA拷

21、貝數(shù)。7000型可以動態(tài)顯示PCR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于7個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通PCR儀使用。ABI已經(jīng)發(fā)布12萬個商品化的定量PCR試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因，平均每個基因3個檢測試劑盒，為運用7000、7700、7900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。    7000型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為530590 nm，能夠有效地分辨FAMTM / SYBR? Gree

22、n I、 VICTM / JOETM、TAMRATM和ROXTMspan等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、spanSNPspan分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時對多個目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。    7000型支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve功能用于判斷PCR擴增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. &q

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