熒光定量PCR在中醫(yī)藥研究中的應用

1、熒光定量PCR在中醫(yī)藥研究中的應用    摘要：熒光定量PCR是一種新的核酸定量技術，該技術在PCR儀反應系統(tǒng)中引入了熒光標記探針，通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使PCR擴增和終產物檢測全處在封閉的條件下進行，從而具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精確、特異等特點，極大的克服了原有     摘要：熒光定量PCR是一種新的核酸定量技術，該技術在PCR儀反應系統(tǒng)中引入了熒光標記探針，通過熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使PCR擴增和終產物檢測全處在封閉的條件下進行，從而具有實時監(jiān)測、無污染、快速、靈敏、精

2、確、特異等特點，極大的克服了原有PCR儀技術的不足，其最主要的優(yōu)勢是能對待測樣本起始PCR反應模板進行準確定量，擴大了PCR的應用范圍，熒光定量PCR已廣泛用于生物學及臨床醫(yī)學等多個領域，近年來其在中醫(yī)藥研究中得到越來越多的應用。 關鍵詞：熒光定量PCR;中醫(yī)藥;應用 中圖分類號：R2-03 文獻標識碼：A 文章編號：1673-7717(2008)04-0758-03 熒光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q PCR)，又稱實時定量（real-time quantitative）PCR，F(xiàn)Q PCR是在PCR技

3、術基礎上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，1996年由美國Applied Biosystems公司首先推出。它是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。它的特點是：（1）用產生熒光信號的指示劑顯示擴增產物的量。（2）熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標記的序列特異性熒光探針或能量信號轉移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。（3）進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光檢測，消除了標本和產物的污染，且無復雜的產物后續(xù)處理過程。與傳統(tǒng)的PCR相比，實時定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少試驗過程中產生污染的

4、危險1。 熒光定量PCR的出現(xiàn)克服了傳統(tǒng)PCR技術普遍存在的假陽性及不能定量等問題，使得PCR技術更廣泛的應用于臨床，在監(jiān)測患者病情、預后、指導用藥等方面有著廣闊的應用前景2。熒光定量PCR也越來越多地被應用于中醫(yī)藥的研究，為中醫(yī)藥理論及其臨床研究提供了更為客觀的物質基礎。 1熒光定量PCR在中醫(yī)藥防治乙肝中的應用 1.1對乙肝的中醫(yī)辨證分型客觀化 量化的探索確定證型是中醫(yī)辨證施治的前提，雖然對慢性乙肝的中醫(yī)辨證分型已作了統(tǒng)一規(guī)范，但這些規(guī)范仍停留在傳統(tǒng)的望、聞、問、切上，缺乏統(tǒng)一的量化和客觀公認標準，給大規(guī)模的臨床研究和實施循證醫(yī)學帶來許多困難。因此，探索慢性乙肝中醫(yī)證型與客觀監(jiān)測指標間的關

5、系，不僅是中醫(yī)現(xiàn)代化的要求，也成為中西醫(yī)結合的熱點3。 有學者觀察慢性乙肝患者乙肝病毒（HBV）復制與中醫(yī)證型關系，發(fā)現(xiàn)實證較虛證活躍，進一步研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者易發(fā)生HBV前C區(qū)突變，而以濕熱中阻型乙肝易發(fā)生，脾腎陽虛型乙肝不易發(fā)生，表明實證者細胞免疫功能亢進。 而另有人研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA按肝郁脾虛、濕熱中阻、竅血阻絡、肝腎陰虛依次遞增。新近的研究表明，乙肝病毒可以分為A、B、C、D、E、F、G、H等若干基因型。在乙肝病毒治療過程中，通常伴隨著HBV病毒的基因型及血清學的轉換。研究發(fā)現(xiàn)，基因型的分布與人群和地理位置有關。如在香港地區(qū)被證實屬于B型或C型，而在瑞士主要為A型到E型以A型和D

6、型最多。同時不同基因型的乙肝病毒對所用治療藥物的敏感性也有差異3。楊麗莎等4研究表明乙肝患者濕熱滯留型HBV-DNA含量在5×1065×109CPS/mL的濃度比例最多，正虛邪戀HBV-DNA含量在5×1035×105CPS/mL的濃度比例最多，HBV-DNA含量低于濕熱滯留，而高于無癥狀攜帶組，在乙肝病毒含量檢測項目中異常變化順序是濕熱滯留>正虛邪戀>癥狀攜帶，可見病毒含量的濃度與濕熱輕重密切相關，濕熱含量越重者病毒含量越高。而徐秋英等5觀察發(fā)現(xiàn)HBV-DNA按濕熱中阻、肝腎陰虛、脾虛肝郁、脾腎陽虛、郁血阻絡依次遞減。 根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，筆者在

7、研究乙肝證型規(guī)范化時，若采用熒光定量PCR的方法，并結合乙肝的血清學標志及基因型標志，很可能對乙肝各證型的科學內涵做出更為明確的解釋。 1.2在乙肝的診斷和治療中的價值中草藥抗病毒作用眾所周知，但由于酶免法檢測乙肝標志物不能真實地反映患者體內乙肝病毒的復制情況，在觀察乙型肝炎療效方面缺乏量化的指標，而乙型肝炎熒光定量PCR檢測可以對乙肝病毒的復制水平進行動態(tài)觀察，根據(jù)患者血清HBV-DNA的拷貝數(shù)進行辨證分型，同時預測和評價中草藥及干擾素的治療效果，對臨床有重要指導意義5。 傳統(tǒng)的酶免法檢測乙肝病毒標志物檢測的靈敏度一般需要1057個病原體，熒光定量PCR檢測的靈敏度則可達到0.01fg，相當

8、于2.5個HBV-DNA顆粒。酶免法檢測的是乙肝抗原抗體系統(tǒng)，在特異抗體產生之前，乙肝病毒就已出現(xiàn)在外周血中，但在血液中無法檢測到，這樣就出現(xiàn)了一個免疫學檢測的“窗口期”問題，從而不能真實地反映患者體內乙肝病毒的復制情況。熒光定量PCR是直接從血液中檢測乙肝病毒DNA，這就解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，從而判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)或者是現(xiàn)癥感染還是既往感染5。 在療效觀察上不能以單純的HBeAg抗原的消失或臨床癥狀的改善和消失為判定依據(jù)，在治療的一些肝炎病例中，采用免疫測定法檢測到HBsAg為陽性，而HBeAg為陰性者，不被確診為乙肝活動期，預后也不存在轉陰問題。然而患者的癥狀與乙

9、型肝炎癥狀相似，通過中藥治療后患者大多數(shù)好轉，有的甚至痊愈。究竟這些患者是否乙肝活動期、有沒有HBV-DNA，經PCR檢測發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)HBeAg陰性攜帶者存在病毒復制具有傳染性，因此，血清轉化并不能說明HBV的消除及感染性的喪失。這也說明中藥對乙肝有確切的療效，它通過中和乙肝病毒，抑制其復制，并能及時清除抗原-抗體復合物，從而達到疏肝、清肝、瀉肝、平肝、鎮(zhèn)肝、養(yǎng)肝、柔肝、溫肝的治療作用6。 利用熒光定量PCR技術，可直接檢測臨床標本中的HBV-DNA存在的情況，這對確定患者血液的感染性，乙肝病毒持續(xù)感染中疾病的活動情況，進而采取相應的預防和治療措施，以及對中藥抗病毒藥物療效的評價，都具有非常重

10、要的意義。 2熒光定量PCR在評價中醫(yī)藥抗病毒療效中的應用 近些年越來越多的把熒光定量PCR運用于評價中藥或復方在抗病毒方面作用的研究中，進一步地明確了中藥的治療效果和作用機制，使中醫(yī)藥的作用得到更為客觀、定量的體現(xiàn)。 范瑞強等7在探討中藥抗病毒膠囊治療生殖器皰疹的研究中運用熒光定量PCR檢測豚鼠生殖道單純皰疹病毒（HSV）2型的含量，發(fā)現(xiàn)抗病毒膠囊可以減少脊髓神經節(jié)HSV-2DNA的含量。蔡有齡等8考察中藥“疣毒清”對尖銳濕疣病毒（HPV）的殺滅作用發(fā)現(xiàn)，在提取的HPV中加入中藥“疣毒清”后，在4下孵育，按時提取HPV-DNA，用熒光定量PCR法測定其病毒含量，經24h后即不能測出HPV，證

11、實“疣毒清”具有明確的殺滅HPV的作用，找到了其在臨床上單純口服即能治愈尖銳濕疣且不再復發(fā)這一事實的機理。李蕓茜等9探討黃芪顆粒劑對剛地弓形蟲RH株速殖子感染小鼠的治療作用，用熒光定量PCR檢測肝、肺弓形蟲DNA基因拷貝數(shù)，通過比較各組小鼠的平均存活時間發(fā)現(xiàn)黃芪可以改善低劑量速殖子小鼠的存活情況。童光東等10通過對HBV轉基因小鼠的實驗觀察，證明加味四逆散具有一定的抑制其血清中與肝組織中HBV-DNA的作用。吳建軍等11研究雙黃連粉針劑對人巨細胞病毒（HCMV）感染的小鼠肝組織病毒DNA載量的影響，實驗表明雙黃連能明顯降低感染小鼠肝組織中病毒DNA載量，能減輕HCMV型肝炎模型鼠肝功能損害，改

12、善肝臟病理變化。李薇等12探討中藥雙黃連注射液對人胚腦單純皰疹病毒型腦炎模型的抑毒作用，實驗證實雙黃連可通過減少病毒DNA的復制，對單純皰疹病毒型腦膜炎模型的病變起到抑制病毒的作用。 3熒光定量PCR在中醫(yī)藥引起基因表達變化作用中的應用 俞建等13研究滋陰瀉火中藥對青春期大鼠中樞生長相關基因的影響，設立對照組，采用熒光定量PCR法，檢測不同劑量中藥對于青春期大鼠下丘腦及垂體部分生長相關基因的影響。結果滋陰瀉火中藥對于下丘腦促生長激素釋放抑制激素(SRIH)基因表達，中、大劑量治療組顯著增高，表明其可能通過上調SRIH基因表達調節(jié)生長激素分泌，從而對青春期大鼠的生長發(fā)育起到一定的抑制影響。王琳等

13、14應用實時定量熒光PCR方法研究復方861對人肝星狀細胞（LX-2）中-平滑肌肌動蛋白（-SMA）基因表達的調節(jié)作用。結果表明，復方861在48和72h后可顯著降低LX-2細胞中-SMA mRNA含量，提示其抗纖維化作用可能與抑制LX-2細胞的活化有關。張黎等15研究何首烏水溶性成分2，3，5，4-四羥基二苯乙烯2-D葡糖苷（STI）對溶血磷脂酰膽堿(LPC)誘導人臍靜脈內皮細胞株ECV304細胞中血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響，用熒光定量PCR檢測STI使VEGF mRNA表達成劑量依賴性降低，說明對其有明顯抑制作用，基于VEGF與動脈粥樣硬化的相關性，從而STI可能對動脈粥樣硬化

14、的預防及治療有良好的開發(fā)前景。張榮華等16觀察益骨膠囊預防和治療用藥對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織中的骨重建關鍵性轉化生長因子（TGF-）的影響，通過檢測TGF-1mRNA含量，在分子水平上闡明益骨膠囊防治骨質疏松癥的可能作用機制，結果益骨膠囊能促進骨組織TGF-1mRNA基因表達。張永芳等17探討知母活性成分ZDY101對M2受體mRNA穩(wěn)定性的調節(jié)，實驗證實ZDY101能提高M2受體mRNA的穩(wěn)定性，使細胞M2受體的mRNA含量升高，ZDY101可用于阿爾茨海默病的治療。楊禮騰等18運用熒光定量PCR等研究表明，冬蟲夏草的發(fā)酵粉末對肺纖維化膠原代謝有明顯的調控作用，其作用機制可能為抑制轉化生長

15、因子TGF-1mRNA表達的上調，從而干擾TGF-smads信號通路對靶基因的激活而實現(xiàn)的。朱昭明等19研究通腎絡1號對高糖狀態(tài)下大鼠腎系膜細胞金屬蛋白酶2（MMP-2）及其抑制物2mRNA(TIMP-2mRNA)的影響，運用熒光定量PCR法及ELISA法檢測MMP-2、TIMP-2mRNA轉錄水平及細胞培養(yǎng)上清產物FN、ColIV（二者為細胞外基質主要成分）的含量，結果表明通腎絡1號可降低細胞上清FN、ColIV含量，這種作用是通過提高MMP-2mRNA水平，降低TIMP-2mRNA水平，達到升高MMP-2/ TIMP-2比值實現(xiàn)的。這一研究進一步明確了糖尿病腎病的發(fā)病機制及通腎絡1號的治療

16、作用。 4熒光定量PCR在舌診研究中的應用 許冬青等20采用基因芯片及實時定量PCR技術研究舌癌患者不同舌苔舌背黏膜上皮細胞表皮。生長因子受體（EGF-R）表達的差異，以期從基因分子水平探討不同舌苔形成機理，為中醫(yī)診斷現(xiàn)代化提供實驗依據(jù)。結果表明，不同舌苔上皮細胞EGF-R基因表達水平存在明顯差異，EGF-R可能是影響舌苔形成的重要因素之一。已有報道，不同舌苔的形成與舌上皮細胞凋亡基因的表達及細胞生化代謝等有關，說明舌苔變化可能是多基因聯(lián)合調控的結果，其機制有待于進一步深入研究。 5結語 綜上所述，熒光定量PCR作為一種新的核酸定量技術，在以前的PCR技術基礎上得到進一步發(fā)展，大大降低了假陽性

17、率，工作效率高，結果重現(xiàn)性好，而且不必使用對人體有害的染色劑。在中醫(yī)藥迫切需要得到進一步發(fā)展的今天，熒光定量PCR技術已越來越多在中醫(yī)藥研究中得到應用，除上述應用外，熒光定量PCR還可進一步運用于對中醫(yī)證實質的研究及構建中醫(yī)證的相關基因表達圖譜，用于探討中醫(yī)經絡現(xiàn)象和針灸的作用機理以及對中藥材進行分子生物學檢測，熒光定量PCR必將不斷擴大其應用領域。隨著PCR技術在中醫(yī)藥研究中的廣泛應用，它將極大的促進中醫(yī)藥的發(fā)展，為中醫(yī)學走向世界、走向現(xiàn)代化作出貢獻。 參考文獻 1蔡霞.定量PCR技術及其應用現(xiàn)狀J.現(xiàn)代診斷與治療，2005，16（2）：112-115. 2鄧少麗，羅陽，陳偉.熒光定量PCR

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