離子交換纖維素在實(shí)驗(yàn)室中的用法

1、Whatman離子交換纖維素在實(shí)驗(yàn)室中的用法有關(guān)如何使得介質(zhì)獲得最佳結(jié)果達(dá)到最佳分離結(jié)果Whatman公司已為蛋白質(zhì)、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開(kāi)發(fā)了一系列Whatman離子交換纖維素。在使用時(shí)只有確切的按注意事項(xiàng)操作才能得到最佳分離效果。介質(zhì)種類 類型干品預(yù)溶脹 陰離子交換 陽(yáng)離子交換 物理形態(tài) 纖維狀 微粒狀微粒狀全離子化微粒 比52型結(jié)合力較弱的微粒狀 比52型結(jié)合力較弱的微粒狀比52型結(jié)合力強(qiáng)的全離子化微粒交換劑的預(yù)處理1 預(yù)溶脹（51，52和53）型離子交換劑不用預(yù)先反復(fù)處理就可使用。但必須用緩沖鹽充分平衡。預(yù)溶脹的離子交換劑在每次預(yù)處理或再生后使用不要用任何方法使它變干

2、。2 為了得到盡可能好的結(jié)果，對(duì)于干的離子交換纖維素（23和32）預(yù)處理的每一步必須按下面即將介紹的流程進(jìn)行操作。3 DE51、QA52、SE52和SE53含防腐劑。此類物質(zhì)會(huì)在平衡和裝柱時(shí)自動(dòng)隨之除去。如果離子交換劑還進(jìn)行平衡，則防腐劑可以用蒸餾水或者去離子水進(jìn)行洗滌。第一部分 干型離子交換纖維素預(yù)處理1 稱量好的的離子交換劑添加到15倍容積（W/V）酸或堿溶液中輕輕攪動(dòng)，進(jìn)行第一次處理。2 微粒產(chǎn)品至少浸泡30min，纖維狀產(chǎn)品至少浸泡60min。3 濾出上清液，用水洗至下列“中間pH”。4 再用15倍容積的酸或堿溶液浸泡進(jìn)行二次處理，放置30min，濾出上清液。5 重復(fù)上述“4”二次處理

3、，然后用水洗至洗液呈中性。處理?xiàng)l件型號(hào) 一次處理 中間pH 二次處理DE 0.5NHCl 4.0 0.5NNaOH CM 0.5NNaOH 8.0 0.5NHCl注意：對(duì)預(yù)溶脹的微粒狀產(chǎn)品（51，52和53型）不需進(jìn)行這一步，因此干型產(chǎn)品用在大規(guī)模柱層析分離更好。第二部分 預(yù)溶脹型離子交換纖維素和預(yù)處理后的干型離子交換纖維素 交換劑懸浮液的準(zhǔn)備一般QA52型和SE52型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液中平衡時(shí)間比DE52和CM52型更短。而且所有介質(zhì)當(dāng)采用的緩沖液離子與離子交換劑的相一致時(shí)，所需的平衡液體積最小，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris HCl Buffer）對(duì)DE或

4、QA型離子交換劑平衡所需時(shí)間和體積都要比用醋酸鹽類緩沖鹽少。所有情況下實(shí)際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高，（典型的高10倍），這樣有利于交換劑的預(yù)平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。離子交換劑裝柱后在進(jìn)樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進(jìn)行平衡，通常將2-4倍柱床容積的低濃度緩沖液通過(guò)填充柱就可以完成平衡。推薦的方法1 在使用之前用緩沖液（0.2-1.0M）輕輕搖動(dòng)攪拌離子交換劑2-3min。最初取干型纖維素時(shí)每克干品約用15-30mL緩沖液，濕離子交換劑約用6mL/g。2 在攪拌時(shí)緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH調(diào)到所希望的值。3 讓懸液沉降并傾出上清液中的細(xì)小顆粒

5、。4 再次使用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總?cè)莘e按30mL/g計(jì)，濕離子交換劑約為6mL/g。5 離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無(wú)灰塵、無(wú)直射陽(yáng)光和不發(fā)熱的地方，沉降時(shí)間可按t = nh 式計(jì)算。式中：t = 時(shí)間（min），h = 量筒中懸液總高度（cm），n = 系數(shù)可取1.32.4。6 注意“濕沉降體積”是離子交換劑在規(guī)定條件下沉降后所占的體積。除去上清液中所含細(xì)粒后留在量筒中的最終體積是“濕沉降體積”加20%。7 填裝短柱或長(zhǎng)柱時(shí)懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產(chǎn)品的長(zhǎng)柱床的密度需用“濕沉降體積”加50%。變換緩沖液可用的方法1 按上項(xiàng)（1）那樣輕輕

6、攪拌離子交換劑到一定容積的緩沖液中。2 放置10min，傾出或?yàn)V出上清液。3 重復(fù)處理直到濾液或上清液確實(shí)與緩沖液的pH和電導(dǎo)率一樣為止。變換緩沖液后必須核對(duì)pH。當(dāng)采用低濃度緩沖液時(shí)本方法會(huì)有所變化，且需要增加處理的時(shí)間。4 除去細(xì)顆粒和裝柱的準(zhǔn)備工作請(qǐng)按上述（4）（5）和（6）項(xiàng)進(jìn)行。裝柱在裝柱時(shí)必須避免離子交換劑和緩沖液的對(duì)流翻動(dòng)。為此必須使懸浮液倒入柱中瞬間使離子交換劑形成沉降柱床曾，操作進(jìn)行得盡可能快，否則懸液中的對(duì)流需很長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)停下來(lái)。1 離子交換用柱應(yīng)該垂直置于無(wú)灰、無(wú)直射陽(yáng)光和不發(fā)熱等環(huán)境中。2 假如選液體積大于柱體積時(shí)，應(yīng)該另外接一段延長(zhǎng)管。3 輕輕攪動(dòng)下將懸液倒入柱中。4

7、 讓洗脫液從柱中排出。5 全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。6 緩沖液用泵或流動(dòng)法通過(guò)柱子，流速控制至少45ml/hr/cm2柱子內(nèi)截面積，直到柱床高度恒定。7 停止緩沖液流進(jìn)或流出柱子。8 取下延長(zhǎng)管（若裝著）并換上柱頂蓋。平衡需要強(qiáng)調(diào)的是必須正確讀取pH和電導(dǎo)率。對(duì)真正的平衡而言平衡后的溶液應(yīng)該與起始緩沖液一致，必須做到不僅連續(xù)兩次平衡溶液的讀數(shù)相同，而且要去起始緩沖液相同。不正確的平衡是產(chǎn)生無(wú)重現(xiàn)性結(jié)果的原因。 起始緩沖液流過(guò)柱子直到流出液的電導(dǎo)率和pH精確地與起始緩沖液相同。此方法適用于開(kāi)始時(shí)用低濃度緩沖液的柱分離。樣品準(zhǔn)備和加樣樣品溶于起始緩沖液中并調(diào)整溶液的pH。細(xì)胞提取物和硫酸銨沉

8、淀物要用層析柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無(wú)法重現(xiàn)的結(jié)果。被分離物通常在低流速時(shí)加樣。 洗脫加樣品后立刻開(kāi)始洗脫或在規(guī)定時(shí)間內(nèi)開(kāi)始。層析分離通常采用三種方法。有分步洗脫、連續(xù)梯度洗脫和分段梯度洗脫。分步洗脫離子交換劑平衡和樣品混合物準(zhǔn)備時(shí)所有緩沖液也可在洗脫時(shí)用，洗脫可以有兩種方式完成：1 目的物分子是游離狀態(tài)的。所需離子交換劑量要根據(jù)混合物污染程度、結(jié)合力和成分不同而定。柱床高度在這種方式操作中并不重要。2 目的物分子是結(jié)合狀態(tài)的。層析時(shí)混合物是由相類似的成分組成的，為了獲得最佳分離應(yīng)選用相對(duì)長(zhǎng)的柱子。可取的是只用了柱總?cè)萘康暮苄∫徊糠郑ㄈ?%）。應(yīng)避免離子交換劑平衡和柱中層析分

9、離兩者選用不同的緩沖液，除非系統(tǒng)已經(jīng)明確顯出會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果時(shí)才考慮。梯度洗脫連續(xù)地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當(dāng)?shù)膒H，或者兩者都改變。緩沖液本身是達(dá)到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對(duì)目的化合物的交換容量而定。萬(wàn)一混合物含層析相近似的組分時(shí)，為了獲得好的分辨力需要稍增加些柱長(zhǎng)度。特殊技術(shù)滅菌所有whatman離子交換介質(zhì)除P11型之外為了滅菌都可以高壓滅菌。最好是離子交換劑用PH6.57.5的非揮發(fā)性緩沖液配成的懸液中進(jìn)行。建議的滅菌條件是10psi/15min；或者15psi/10min；。另外除P11型之外所有的

10、產(chǎn)品也可以用化學(xué)滅菌法，將介質(zhì)分散在0.5MNaOH中，然后用滅菌水洗滌。所有產(chǎn)品也可用含2025%體積百分比的乙醇水溶液處理。脫氣（對(duì)陰離子交換劑）對(duì)大多數(shù)靈敏的分離，為了獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，DE和QA纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預(yù)先按上述推薦的方法處理過(guò)后一般就不必進(jìn)行這一步。1 將纖維素加到酸性緩沖液中。2 調(diào)整pH在4.5。有時(shí)甚至要用更高濃度的酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH。3 在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg以下）直到?jīng)]有更多的氣泡產(chǎn)生，在不產(chǎn)生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進(jìn)行，抽濾瓶與吸氣器相連。4 加堿性緩沖液使得所希望的pH。對(duì)要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO2的水配制以保證無(wú)CO2。采用含醇緩沖液對(duì)SE53型介質(zhì)需要含醇緩沖液，平衡時(shí)先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統(tǒng)完成平衡。分批法離子交換1 將一定量的已預(yù)處理并平衡過(guò)無(wú)細(xì)粒的離子交換劑加到原溶液中。2 按原溶液中所含成分的容量攪動(dòng)一定時(shí)間進(jìn)行吸附分離。3 用過(guò)濾法或者離心法將離子交換劑