組織培養(yǎng)法在關(guān)節(jié)軟骨保存中的應(yīng)用

1、組織培養(yǎng)法在關(guān)節(jié)軟骨保存中的應(yīng)用                作者：宋洪強(qiáng)，亓建洪，玄燕華，畢研花 【摘要】  目的探討3種保存方法對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的不同影響，尋求效果優(yōu)良的軟骨組織保存方法。方法切取成年豬骨軟骨，制成約4.5 mm×5 mm大小的圓柱形骨軟骨塊。采用組織培養(yǎng)法、慢速梯度降溫冷凍法、傳統(tǒng)慢速連續(xù)降溫冷凍法對(duì)軟骨塊進(jìn)行保存處理，觀察并比較保存后軟骨細(xì)胞活性的變化。結(jié)果保存8周時(shí)，采用傳統(tǒng)冷凍法的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存

2、活率不足50，軟骨基質(zhì)成分大量丟失；采用慢速梯度降溫冷凍法的細(xì)胞存活率66，而使用組織培養(yǎng)法保存的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率高達(dá)76%以上，軟骨基質(zhì)成分僅少量丟失。結(jié)論3種方法相比較，組織培養(yǎng)法可以長(zhǎng)期保存關(guān)節(jié)軟骨組織活性，是更為理想的軟骨組織保存方法。 【關(guān)鍵詞】  關(guān)節(jié)軟骨； 保存； 組織培養(yǎng)； 活性    Abstract：ObjectiveTo study the effects of different storage method on the viability of cheodroeytes so as to find out the idem

3、method for preservation of articular cartilage.MethodUnder the aseptic condition,acquiring 240 pieces of osteoehondral plugs from both condyles of femur and tibial plateau.The control group was not treatment using any preserved means.The tissue?cultured group was to used F12?DMEM medium long?term pr

4、eserved osteochondral plugs under the conditions of 37 .At preserve 8 weeks,takes the osteochondral section to carry on examination observation ohondrocytes Viability activeness change separately.ResultThe control group chnadrocyte survival rate was 94.4%.At preserves 8 weeks,the cell survival rate

5、of the tissue?cultured group was 76%,the grading?cooling cryopreservation group was 66%,the constant?cooling cryopreservation group only was 41.80%.ConclusionUnder the condition of 37 ,tissue culture method can long term preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rat

6、e of the preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the tissue?cultured method obvious higher than constant?cooling cryopreservation method.    Key words：articular cartilage;  preservation;  tissue?cultured;  viability  

7、;  異體骨軟骨移植物的保存尚無理想的方法，這明顯制約了異體軟骨移植的臨床應(yīng)用，如何保存軟骨組織的活性，對(duì)于保證移植的成功至關(guān)重要。因此，作者進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)，希望找到更為理想的軟骨組織保存方法。    1  材料與方法    1.1  主要試劑與儀器    F12-DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；程序降溫儀器：國(guó)產(chǎn)RBL?PA?并裥統(tǒng)絳蚶潿騁牽煥潿潮嬉瞧鰨?SANYO-80 深低溫冰箱。    1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 &#

8、160;  取清潔級(jí)健康成年長(zhǎng)楓白豬10只20膝，無菌條件下在髕股關(guān)節(jié)及脛股關(guān)節(jié)切取正常骨軟骨，制成直徑約4.5 mm、長(zhǎng)約5 mm的圓柱形骨軟骨塊240枚。將骨軟骨塊隨機(jī)分為4組，每組60枚。備用。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    將骨軟骨塊隨機(jī)分為4組，每組60枚。分別為：    對(duì)照組：即新鮮軟骨標(biāo)本不采取任何處理措施，取材半小時(shí)內(nèi)即行組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)MTT比色法測(cè)定存活率。    實(shí)驗(yàn)組包括：  

9、0; 組織培養(yǎng)組（A組）：將取材的骨軟骨塊按體積比115放入配制的普通無菌F12?DMEM混合培養(yǎng)液（含有100 Uml的青鏈霉素，pH值7.27.4）中，放入37 CO2培養(yǎng)箱保存，隔日換液1次。    慢速梯度降溫冷凍組（B組）：將骨軟骨塊浸泡于4 無菌含有15DMSO的玻璃化保護(hù)液中浸泡2 h，然后3層無菌血漿袋包裝后進(jìn)行降溫。先以-1 min的速率從室溫降溫至-4 ，維持30 min，然后以-1 min的速度降溫至-10 并維持30 min，進(jìn)而以-1 min的速度降溫至-20 ，維持30 min，再連續(xù)降溫至-40 ，維持30 min，最后放入-80 深

10、低溫冰箱中保存。    慢速連續(xù)降溫冷凍組（C組）：采取文獻(xiàn)1報(bào)道的傳統(tǒng)方法，將骨軟骨塊先在4 無菌10 DMSO中浸泡1 h，然后3層無菌血漿袋包裝后進(jìn)行降溫。首先以-1 min的速率連續(xù)降溫至-40 ，再投入-80 深低溫冰箱保存。    保存后處理：實(shí)驗(yàn)組于保存8周時(shí)分別取軟骨塊進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)，冷凍2組軟骨塊自冰箱取出后，立即行37 水浴復(fù)溫（復(fù)溫速率約100 min）10 s，將標(biāo)本從包裝袋取出依次投入10、5的蔗糖溶液（37 ）中各停留5 min（洗除融解的凍存液，防止冷凍保護(hù)劑對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性），最后移至PBS液沖洗3遍。

11、組織液培養(yǎng)組從培養(yǎng)液中取出標(biāo)本，立即在無菌PBS緩沖液中漂洗3遍，清洗掉殘存的培養(yǎng)液。    1.4  實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)：    1.4.1  軟骨細(xì)胞代謝活性檢測(cè)    取20枚標(biāo)本4多聚甲醛固定36 h，沖洗，10%EDTA脫鈣2周，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，石蠟切片，行甲苯胺藍(lán)染色觀察軟骨基質(zhì)蛋白多糖含量的變化、Collagen 免疫熒光化學(xué)染色觀察軟骨基質(zhì)中Collagen 的變化。    1.4.2  軟骨細(xì)胞存活率檢測(cè)（MTT比

12、色法）    將其他40枚標(biāo)本取出后，不經(jīng)固定處理，切取骨軟骨塊的軟骨層，不帶有軟骨下骨等其他組織，稱重后（每組均稱取1g）將軟骨切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊，移入20 ml的離心管，按三步酶消化分離2進(jìn)行組織消化。原代軟骨細(xì)胞的收獲及計(jì)數(shù)：將組織消化液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾入100 ml燒杯中，以DMEM HamF12培養(yǎng)液稀釋，分裝入50 ml離心管，2 000 rmin離心10 min，棄上清。加入適量培養(yǎng)液簡(jiǎn)單吹打漂洗后，1 500 rmin離心，5 min，棄上清，重復(fù)1次后，加入含體積分?jǐn)?shù)為10FCS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，吹打?yàn)?/p>

13、均勻的單細(xì)胞懸液，取樣3次，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值及細(xì)胞收獲的總數(shù)，軟骨細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)：取所需量的原代軟骨細(xì)胞懸液，以3×104個(gè)細(xì)胞cm2的密度、含體積分?jǐn)?shù)為10FCS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液接種于24孔培養(yǎng)板，置于37 、體積分?jǐn)?shù)為5CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。接種48 h后首次換液，以后隔天換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至8090融合時(shí)，在24孔培養(yǎng)板的6孔中加入0.15 ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)液，加入15 ml DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值（OD值表14），測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，以只加培養(yǎng)液的6孔作為空白對(duì)照。細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組光吸收值對(duì)照組光

14、吸收值×100。    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    所有數(shù)據(jù)均用x-±s表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)各組的細(xì)胞存活率計(jì)量數(shù)據(jù)資料采用單因素方差分析q檢驗(yàn)，P0.05表示具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。     2  結(jié)  果    2.1  軟骨細(xì)胞代謝活性的觀察    2.1.1  甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果    對(duì)照組可見，正常關(guān)節(jié)軟骨

15、細(xì)胞分散在藍(lán)色背景下，甲苯胺藍(lán)著色在軟骨深層組織較深，在軟骨淺中層組織顏色較淡，整體軟骨基質(zhì)異染性明顯（圖1a）。組織保存8周時(shí)可見，A組基質(zhì)異染性較好，甲苯胺藍(lán)染色輕度減退（圖1b），B組基質(zhì)異染性較差，著色中度減退（圖1c）；C組基質(zhì)異染性差，組織著色明顯減退（圖1d）。    2.1.2  型膠原免疫熒光染色結(jié)果    對(duì)照組可見，SABC?CY3免疫熒光法標(biāo)記關(guān)節(jié)軟骨中的Collagen ，陽性顆粒呈鮮紅色，定位于軟骨基質(zhì)，大致排列呈“拱形結(jié)構(gòu)”（圖2a）。組織保存8周時(shí)可見，A組Collagen 表達(dá)的熒光強(qiáng)度輕度

16、降低（圖2b）；B組中度降低（圖2c）；C組重度降低，提示基質(zhì)中Collagen 大量丟失（圖2d）。    2.2  軟骨細(xì)胞存活率的觀察    MTT比色法測(cè)定軟骨細(xì)胞存活率，在酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值（OD值）（表14），細(xì)胞存活率=試驗(yàn)組OD值對(duì)照組OD值×100。表1  新鮮組OD值表2  組織培養(yǎng)組OD值表3  慢速梯度降溫冷凍組OD值表4  慢速連續(xù)降溫冷凍組OD值3  討  論    關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)問題已經(jīng)困擾

17、人們很多年，同種異體骨軟骨移植對(duì)局限性軟骨缺損替代修復(fù)是一個(gè)很好的方法。張海寧等3研究證實(shí)：同種軟骨移植能以類似透明軟骨的結(jié)局修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性類似于正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并且移植的近期效果優(yōu)于軟骨下骨鉆孔術(shù)。但是，軟骨保存尚無理想的方法，這明顯制約了同種異體軟骨移植技術(shù)的發(fā)展。Schachar報(bào)道4同種異體軟骨移植遠(yuǎn)期效果不理想可能與以下原因有關(guān)：（1）軟骨細(xì)胞存活率多大才足以維持軟骨基質(zhì)的完整性目前尚無定論，但傳統(tǒng)冷凍保存的軟骨細(xì)胞約50%的存活率太低；（2）存活軟骨細(xì)胞的代謝活性下降，不能合成足夠的基質(zhì)；（3）冷凍保存損傷了軟骨基質(zhì)的完整性，而存活的軟骨不能進(jìn)行修復(fù)。如何保

18、存軟骨組織的活性，對(duì)于保證移植的成功至關(guān)重要。既往保存軟骨的方法常用的有：化學(xué)保存方法如用甲醛、酒精、硫柳汞等保存的軟骨均會(huì)導(dǎo)致軟骨失去活性，此種無活性的軟骨移植物因其易變性、吸收及排斥反應(yīng)大等缺點(diǎn)，從而使其應(yīng)用大為受限。    近年，隨著低溫醫(yī)學(xué)的發(fā)展，冷凍方法成為目前最常用的軟骨保存方法之一。伴隨著冷凍參數(shù)、低溫保護(hù)劑、冷凍程序等方面的不斷改進(jìn)，此方法取得了很大進(jìn)步。但是，隨之發(fā)現(xiàn)其雙面性，在保存軟骨活性的同時(shí)造成軟骨細(xì)胞的巨大傷害。迄今為止，有關(guān)冷凍保存軟骨活性的方法，細(xì)胞存活率均很低。近年有實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道5，羊軟骨冷凍保存60 d，軟骨細(xì)胞存活率僅為51.6

19、。在本實(shí)驗(yàn)中，采用傳統(tǒng)冷凍保存方法保存豬軟骨組織8周，細(xì)胞存活率不足50，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果有一致性。本研究認(rèn)為：軟骨基質(zhì)中含有大量水分，可導(dǎo)致冷凍過程中產(chǎn)生大量的冰晶，明顯損傷細(xì)胞活性；軟骨基質(zhì)的屏障作用，可以減少冷凍防護(hù)劑向細(xì)胞內(nèi)滲透的數(shù)量，明顯減弱其保護(hù)作用。因此，對(duì)同種異體骨軟骨移植物保存的傳統(tǒng)方法的改進(jìn)或者新方法的發(fā)明是非常必要的，這對(duì)于促進(jìn)同種異體骨軟骨移植技術(shù)的發(fā)展具有極為重要的意義。    組織培養(yǎng)技術(shù)是一門在體外模擬體內(nèi)生長(zhǎng)條件的基礎(chǔ)上建立的“活體”實(shí)驗(yàn)技術(shù)。近年來有學(xué)者嘗試用組織培養(yǎng)法保存游離軟骨細(xì)胞和皮膚移植片并取得成功。Malinin等6研究

20、認(rèn)為，在低溫條件下（4 6 ），用組織培養(yǎng)法保存軟骨塊時(shí)間不宜超過21 d，否則軟骨細(xì)胞存活率會(huì)發(fā)生時(shí)間依從性下降并出現(xiàn)軟骨退變現(xiàn)象。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，選用37 條件，使用普通F12?DMEM混合培養(yǎng)液保存關(guān)節(jié)軟骨，所用的培養(yǎng)條件近似于體內(nèi)環(huán)境，可以避免低溫?fù)p傷，在8周的保存期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)軟骨基質(zhì)包繞現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞存活率高達(dá)75以上，與傳統(tǒng)冷凍保存方法比較有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果令人振奮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本方法有利于軟骨長(zhǎng)期存活而且對(duì)軟骨基質(zhì)成分影響小，方法可靠，經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便易行。F12?DMEM培養(yǎng)液中含有軟骨細(xì)胞所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，與其他培養(yǎng)基相比，還含有微量元素和無機(jī)離子，營(yíng)養(yǎng)豐富，可以不使用血清，就能夠提供軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足細(xì)胞存活的需要，能長(zhǎng)期維持軟骨細(xì)胞活性。而且，在本實(shí)驗(yàn)采用37 條件組織培養(yǎng)法，避免了冷凍保存方法對(duì)離體軟骨組織造成的巨大凍傷，較好地保護(hù)組織活性，因此是更為理想的保存方法。【參考文獻(xiàn)】  1 李元，張滬生，楊慶銘，等.骨庫(kù)的建立及臨床應(yīng)用J.中華骨科雜志，1995，15（9）：573?574.2 周強(qiáng)