骨形成蛋白在正常兔牙周組織中的表達及定量分析

1、    骨形成蛋白在正常兔牙周組織中的表達及定量分析        【摘要】目的進一步了解骨形成蛋白(BMP)在牙齒及牙周組織中的表達，為研究BMP在牙周組織的修復(fù)再生及骨改建中的作用提供實驗數(shù)據(jù)。方法用BMP單克隆抗體免疫組化染色及計算機像分析的方法對正常兔牙周組織BMP的表達進行了定性、定量分析。結(jié)果在牙周膜中，BMP的分布不同，在靠近牙槽骨和牙骨質(zhì)側(cè)染色較深，成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞染色均呈強陽性，牙槽骨、牙齦染色陰性。近中側(cè)BMP表達量明顯低于遠中側(cè)。結(jié)論正

2、常兔牙周組織中存在BMP，兔上頜第一磨牙生理性牙齒移動的方向可能是向近中側(cè)?！娟P(guān)鍵詞】骨形成蛋白牙周組織免疫組織化學(xué)染色 The distribution and quantitative analysis of BMP in normal periodontal tissue of rabbitsZHANG Chunsheng,CHEN Yuanping,ZHU Xianchun,et al.（School of Stomatology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130041）【Abstract】Objec

3、tiveTo further understand the expression of bone morphogenetic protein (BMP) in the teeth and periodontal tissue and to supply the experimental data for the role of BMP in the reparation of periodontal tissue and the bone remodeling.MethodsThe BMP expression in normal periodontal tissue of rabbits w

4、as analyzed qualitatively and quantitatively using BMP monoclonal antibody with immunohistochemical staining and image analysis system.ResultsThere was BMP expression in normal periodontal tissue of rabbits and the distribution of BMP expression was different in periodontal membrane.the staining nea

5、r alveoli and cementum,was darker,osteoblasts,cementoblasts and fibroblasts demonstrated strong positive staining,alveoli and gum showed negative staining,the BMP expression on mesial side was obviously lower than that on the distal side.ConclusionBMP existed in normal periodontal tissue of rabbits

6、and the direction of physiological tooth movement of the first molar of rabbits could be toward mesial side.【Key words】BMPPeriodontal tissueImmunohistochemical staining骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一種具有高度骨誘導(dǎo)活性的低分子多肽。在人和許多動物的骨組織、牙齒及牙周組織中都有BMP的存在，它主要分布在一些具有成骨傾向的細胞中，并參與骨組織、牙齒組織的形成。本實驗應(yīng)用BMP單克隆抗體

7、對正常兔牙齒及牙周組織進行了免疫組織化學(xué)染色，通過光鏡觀察及計算機像分析的方法對正常兔牙周組織BMP的表達進行了定性、定量分析，以期進一步探討B(tài)MP在牙齒及牙周組織的分布，為研究BMP在牙周組織的修復(fù)再生及骨改建中的作用提供實驗依據(jù)。材料和方法1.主要試劑及儀器：抗骨形成蛋白單克隆抗體(西安第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)，該抗體為小鼠IgG2a，工作濃度為1：50。通用型抗體、DAB發(fā)色劑(寶泰克公司)。計算機像分析儀(加拿大NORTHERN ECLIPSE公司生產(chǎn)、白求恩醫(yī)科大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院提供)。2.主要方法：選用體重在1.5kg左右的健康大耳白兔3只，經(jīng)耳緣靜脈注射20毫升空氣處死。取含左、右側(cè)

8、上頜第一磨牙及其周圍牙槽骨的組織塊兩塊，固定于10%福爾馬林溶液中，15%EDTA脫鈣3周、包埋、制成蠟塊，進行組織切片。組織切片以平行于牙體長軸為標(biāo)準(zhǔn)作近遠中向連續(xù)切片，切片厚度為5微米。切片按常規(guī)SP法進行免疫組織化學(xué)染色?？构切纬傻鞍讍慰寺】贵w工作濃度為1：50，陰性對照組用PBS代替第一抗體。應(yīng)用像分析儀，對每張免疫組織化學(xué)染色后的切片作BMP定量分析。在組織切片上確定4個測量部位：第一磨牙的近中、遠中的牙周膜的近牙骨質(zhì)側(cè)(以下簡稱牙周膜區(qū))和近牙槽骨側(cè)。每個部位隨機選擇3個視野，測量BMP陽性表達的面積。結(jié)果1.BMP單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明：在正常兔牙齒及牙周組織中存在B

9、MP，不同部位BMP的含量不同。在正常兔牙周組織中，BMP主要分布于牙周膜及其周圍組織細胞的胞漿中，但在牙周膜中的分布不均勻，在靠近牙槽骨和牙骨質(zhì)的區(qū)域陽性染色較強，而中間區(qū)域陽性染色較弱；成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞、成纖維細胞染色均呈強陽性，破骨細胞染色呈弱陽性；近中側(cè)牙周膜BMP染色強度小于遠中側(cè)。骨髓腔、血管周圍的細胞胞漿染色也較深，牙槽骨染色陰性，其骨細胞染色也為陰性。牙齦、牙骨質(zhì)染色陰性；管周牙本質(zhì)染色陽性，其余部位均為陰性；根尖上皮鞘BMP染色陰性；牙髓中未分化間充質(zhì)細胞染色陽性，而成纖維細胞染色陰性(見1，陰性對照見2。)2.正常兔牙周組織中不同部位BMP表達量的變化：在正常兔牙周組

10、織中，上頜第一磨牙近、遠中側(cè)牙周膜、牙槽骨表面BMP的表達量明顯不同，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，二者有顯著性差異(見附表)。附表正常兔牙周組織中不同部位BMP表達量的變化近中側(cè)遠中側(cè)P牙周膜區(qū)2.20±1.395.87±1.800.05牙槽骨區(qū)1.34±0.543.95±1.330.05注：±s，近中側(cè)與遠中側(cè)比較，n=3 討論以往的研究表明，在牙周組織的修復(fù)再生中，牙周膜起著重要的作用1，2。體外研究表明，牙周膜細胞具有與牙齦成纖維細胞不同的生物學(xué)特性，并具有骨母樣細胞的生物學(xué)表現(xiàn)。骨形成蛋白(BMP)作為骨生長的促進因子廣泛存在于人和動物的硬組織，定位

11、于成骨及成軟骨細胞、成釉及成牙本質(zhì)細胞等具有成骨傾向的細胞胞漿中，主要由未分化的間充質(zhì)細胞分泌，在局部釋放，誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細胞向成骨細胞方向轉(zhuǎn)化，具有誘導(dǎo)成骨的作用3，4。本研究結(jié)果與劉宏偉5、楊美祥6等通過免疫組織化學(xué)染色觀察正常狗和豚鼠牙齒及牙周組織中BMP的分布的結(jié)果基本一致，進一步認為：牙周膜中的成纖維細胞與牙齦組織中的成纖維細胞不同。牙周膜成纖維細胞具有成骨細胞樣分化能力，有向成骨樣細胞分化并形成硬組織的可能性。本研究利用計算機像分析儀對正常兔牙周組織中BMP的表達進行了定量分析，結(jié)果顯示：正常兔牙周組織近中側(cè)牙周膜、牙槽骨表面BMP的表達明顯低于遠中側(cè)，二者有顯著性差異。生理性牙

12、齒移動是指牙齒在其周圍組織內(nèi)作如牙齒的萌出和近、遠中方向遷移的生理過程，而不致于引起任何病理性結(jié)果的移動，是由Stenin和Weimann在1925年首次提出的，他們發(fā)現(xiàn)成人磨牙向近中方向移動，類似的現(xiàn)象在動物也一樣存在。一般認為不同物種生理性牙齒移動的方向不同，如鼠磨牙向遠中而人磨牙則向近中方向移動。牙齒在生理性移動時，牙槽骨也不斷地進行著吸收和增生的改建。如向近中移動時，牙根遠中面受牽引成骨活躍、骨質(zhì)新生，近中面受壓破骨活躍、骨質(zhì)吸收7，8，而BMP在成骨過程中的表達增強9。本研究結(jié)果顯示正常兔牙周組織遠中側(cè)牙周膜、牙槽骨表面BMP的表達明顯高于近中側(cè)，提示兔上頜第一磨牙生理性牙移動的方向

13、可能是向近中方向的，故近中側(cè)破骨活躍，骨質(zhì)吸收，BMP的表達較低，遠中側(cè)成骨活躍、骨質(zhì)新生，BMP的表達較高。1BMP在正常兔牙周組織的表達：在牙周膜近牙骨質(zhì)和牙槽骨區(qū)域BMP 陽性染色較強，中間區(qū)域較弱；牙骨質(zhì)和牙槽骨染色陰性(10×20)2 陰性對照(用PBS代替一抗)，未見陽性染色(10×20)(本文編輯韓志峰)作者單位：張春生（130041 長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科）陳遠萍（130041 長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科）朱憲春（130041 長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科）孫新華（130041 長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科）胡敏（13

14、0041 長春，白求恩醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科）參考文獻1，Isidor F,Karring T,Nyman S,et al.The significance of coronal growth of periodontal ligament tissue for new attachment formation.J Clin Periodont,1986,13(2):145.2，Caffesse RG,Smith BA,Castelli WA,et al.New attachment achieved by guided tissue regeneration in beagle dogs.

15、J Periodnt,1988,59(9):589.3，Canalis E,Centrella M,Urist MR.Effect of partially purified bone morphogenetic protein on DNA synthesis and cell replication in calvarial and fibroblast culture，1985,198:289.4，王勤濤，吳織芬，史俊南.人牙周膜細胞中內(nèi)源性骨形成蛋白的流式細胞儀分析.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，1997，7(3)：165-167.5，劉宏偉，史俊南，吳織芬，等.骨形成蛋白在狗牙周組織中的分布及其意義.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，1992，2(1)：26-27.6，楊美祥，金