配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對映體的機理

1、    配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對映體的機理        摘要目的：為了較深入的闡述配位金屬離子手性添加劑拆分藥物對映體的機理。方法：本文運用已建立的配位體交換液相色譜(CLEC)方法，以新型配位添加劑(R,R)-酒石酸-單-n-辛胺(TAMOA)為研究對象,將有關文獻進行了總結(jié)和綜述,對其拆分機理及影響因素進行了討論。結(jié)果：運用這種方法進行手性拆分,其機理為:首先拆分樣品與手性添加劑以共價鍵形成五(六)元比較穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),同時手性添加劑（SE）,金屬離子（Me）,

2、外消旋分子（SA）之間形成多種平衡形式的中間配合物;然后,根據(jù)不同配合物在固定相上的保留時間的不同進行拆分。結(jié)論：配位金屬離子手性添加劑CLEC方法拆分條件簡單,成本低,可在手性藥物分析及手性單一體半制備中有廣泛的應用前景。關鍵詞配位金屬離子；手性添加劑；藥物對映體中分類號R966文獻標識碼A文章編號:1008-9926(2000)03-0140-05對映體之間表現(xiàn)出藥理學性質(zhì)上的差異，并非偶然現(xiàn)象，這與有機體內(nèi)存在著“手性環(huán)境” 密切相關。蛋白質(zhì)、酶、受體等生物大分子與手性藥物對映體作用，形成兩種非對映異構(gòu)體結(jié)合物，它們二者的物理性質(zhì)有顯著地差異。因此，可以預測手性藥物對映體之間在藥動學、代

3、謝、轉(zhuǎn)化等方面具有不同的性質(zhì)。Ariens1概括了在藥理學和藥動學研究中進行藥物對映體監(jiān)測的重要性：一般而言，只有一種對映體具有療效，而另一種對映體很可能產(chǎn)生副作用。例如震驚世界的沙立度胺致畸事件，據(jù)研究認為完全由于(S)-(-)異構(gòu)體所致。目前，醫(yī)藥生產(chǎn)中，手性藥物已超過50%，然而有近85%90%的手性藥物仍以外消旋(racemic durg)生產(chǎn)、出售和使用。因此，在臨床用藥和臨床藥理學特別是藥動學研究中，若忽視對映體之間藥理作用上的差異，將付出昂貴的代價。本文就手性流動相(CMP或CMAS)技術在手性藥物分析中的應用，鍵合金屬配位離子形成新的流動相體系中的重要性，及對藥物分析等方面的研

4、究有較大的意義，現(xiàn)將這項技術分離機理與近期進展作一概述。1手性流動相及配位基手性試劑的發(fā)展手性流動相法(CSP)亦稱手性添加劑法(CMAS)，優(yōu)點是拆分化合物不需以手性試劑衍生，也不需價格昂貴的手性固定相（CSP)。而是將手性試劑加到流動相中，使用常規(guī)的正相和反相柱分離。由于方法簡便，引起了廣泛的注意，作用原理有兩種可能：(1) 溶質(zhì)在流動相中手性試劑形成非對映絡合物，因而在固定相和流動相中分配特性不同。(2)手性試劑吸附在柱上形成動態(tài)的CSP2，拆分原理同CSP相似。氨基酸或其異構(gòu)體衍生物的分析技術，在醫(yī)藥，生物化學，化學和地球化學(geochemical)方面的研究不斷增加，其重要性不斷的

5、被人們認識。特別是自1968年Davankov等3報道運用配位體交換液相色譜(Chiral Ligand Exchange liquid Chromatography,CLEC)法分離光學異構(gòu)體，并在此領域內(nèi)作出了很大貢獻4。自此以后，CLEC方法被廣泛的應用。除了氣相色譜(GC)方法中運用氨基酸衍生物進行測定光學異構(gòu)體D,L-比率外5。近幾年，運用氨基酸衍生物在高效液相色譜(HPLC)中進行光學異構(gòu)體分離及測定研究發(fā)展迅速。因此，液相色譜的手性流動相添加劑法的越來越受到重視。2主要手性添加劑有以下幾類2.1蛋白質(zhì)由于蛋白質(zhì)類CSP對多數(shù)藥物有良好的拆分效果，白蛋白和AGP6、7曾作為手性添加

6、劑拆分某些精神藥物如異丙嗪，甲硫噠嗪及雙異丙吡胺等。Pettersson8用蛋白拆分了酸，二羧酸和色胺酸。2.2環(huán)糊精類（CD)以CD制成的CSP對多類化合物都有良好的拆分效果。Deboski9對CD拆分扁桃酸作為系統(tǒng)研究。Sykiska10等以CD拆分巴比妥類藥物，發(fā)現(xiàn)只有嘧啶環(huán)上有不對稱碳原子的巴比妥如美芬妥因，甲基苯巴比妥和海索巴比妥可以拆分。Nobuhara11和Gazadag12分別對流動相的組成，添加劑的濃度及不同型號的C18柱對拆分的影響作了探索。2.3氫鍵型手性試劑Dobashi13以N-乙酰-L-纈氨酸-叔丁酰胺作為手性添加劑對多種氨基酸衍生物有較好拆分效果。2.4配位基手性

7、試劑Lindner14將金屬配合物L-2-異丙基-4-N-乙酰二乙烯四胺-Zn2+加到流動相中，使其動態(tài)的吸附在C18柱上，可用于丹酰氨基酸的拆分。同年Hare15以L-proline-Cu2+為手性添加劑用陽離子交換色譜拆分氨基酸，手性添加劑除L-氨基酸及其衍生物外，光學活性的胺和酰胺亦被采用16。溶質(zhì)與配位基及金屬離子生成兩個三元非對映絡合物，由于穩(wěn)定性或物理性質(zhì)的不同而達到拆分的目的。洗脫順序與一般反相離子一致，溶質(zhì)的疏水性增加，保留時間延長，疏水性氨基酸拆分流動相中應加入一定量的有機該性劑，甲醇或乙腈。2.5手性離子對試劑這一方法是在離子對色譜的基礎上發(fā)展起來，將一般試劑換成手性離子試

8、劑，即可用于有機酸和堿性對映體的拆分。以上所述的5種主要添加劑，拆分的樣品在不同添加劑的色譜柱上有不同的色譜行為，其應用范圍和拆分機理也有一定的差別，國內(nèi)在配位基手性添加劑拆分機理綜述未見文獻報道。較多的文獻報道為運用環(huán)糊精添加劑1723，進行藥物分離研究及環(huán)糊精流動相添加劑的參數(shù)研究。但由于配位金屬離子手性添加劑與柱填料形成穩(wěn)定的和強吸附的手性固定相填料，拆分較完全，成本低，方法簡便，因而其在藥物分析中的必將引起重要作用。近年來，運用配位金屬離子手性試劑在配位基交換液相色譜（CLEC)方面進行了較為廣泛地光學異構(gòu)體的分析方法研究。最初，CLEC手性配位基主要運用二價金屬離子，而且人們主要選擇

9、Cu2+離子，與聚苯乙烯硅膠以共價鍵形式結(jié)合形成固定相。1976年后，Lindner和Karger等24報道了CLEC方面的進展，自從建立了CLEC方法，隨后這種CLEC技術在反相體系中廣泛的應用。在手性添加劑中加入金屬化合物，形成了穩(wěn)定的和強吸附的手性固定相的柱填料，具有較好的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性，和普遍性。在許多CLEC體系中，一般將L-proline CuII作為流動相添加劑類型。目前，我們正在進行L-proline CuII作為流動相添加劑拆分甲狀腺素的研究工作。但也有其它手性添加劑加入到流動相中的研究工作報道15。3配位金屬離子手性流動相添加劑拆分的原理在配位金屬離子手性流動相添加劑拆分中

10、，許多-氨基酸和其衍生物被常常用作手性配位添加劑(chiral chelating selector)SE。同時，Cu2+與氨基酸或丹酰酸(L-AA,Dns-D)被廣泛的運用于分離外消旋分子(racemic molecules)SA，而其它過渡金屬離子Zn(II)，Ni(II)，Cd(II)，Hg(II)比Cu(II)與SE和SA一起拆分外消旋分子的應用少。主要與Cu(II)形成配合物的穩(wěn)定性有關。一般情況下，SE和SA與氨基酸形成的六元環(huán)比五元環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這種現(xiàn)象基于與手性添加劑形成共價鍵，Davankov3使用這種配位形式解釋了與混合配位化合物中，同時形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的色譜結(jié)果。值得注意的是C

11、LEC與形成化合物的機理有關，通常認為 SE和SA必須有一個分子適合與這種結(jié)構(gòu)見1，而且，應考慮如配位基與幾何形狀等因素的改變，同時在CLEC中形成配位體結(jié)構(gòu)中應注意以下的因素:(1)配位原子的性質(zhì)(N,O,P,S)；(2)配位原子的功能(如氨基酸,酰胺,乙腈中的N)；(3)形成環(huán)的大小(4,5,6,7-元環(huán))；(4)配位分子形成一定數(shù)目的配位環(huán)(如,二,三元環(huán))；(5)立體效應由配位體分子(SE,SA)的光學活性的取代基所決定；(6)形成配位體的中心金屬的性質(zhì),氧化態(tài)和配位數(shù)(Cu2+,Ni2+,Zn2+,Co3+ect)；(7)溫度，溶質(zhì)，pH值和緩沖體系。因此，進行手性流動相添加劑的研究

12、工作應注意上述各因素。目前，報道一種新的配位添加劑(R,R)-酒石酸-單-n-辛胺(TAMOA)(R,R)-tartaric acid mono-c-octylamide用于氨基酸異構(gòu)體的分離。TAMOA-Me配位體TAMOA-Me配位體結(jié)構(gòu)見1，配位原子為N,O，與金屬離子形成穩(wěn)定的七元環(huán)。1TAMOA-Me配位化合物的結(jié)構(gòu)手性分離機理，立體選擇鍵合現(xiàn)象(stereoselsctive binding phenomena)和CLEC流動相中添加配位基的理論被認為非常復雜，其原因在于色譜體系中存在多種平衡。討論手性配位交換色譜(CLEC)的影響因素，特別是流動相添加劑類型，主要是緩沖鹽，氫氧離

13、子的濃度，水，有機調(diào)節(jié)劑，氨，金屬離子的鹽的濃度，配位試劑以及它們相互之間的比率。在TAMOA-Me配位體體系中，配位添加劑(TAMOA)和金屬離子(Ni2+)之間在保持其它色譜條件不變的情況下，兩者之間不同比率對分離結(jié)果影響的見表2。當TAMOA和Ni2+摩爾濃度比為11時立體選擇的值最大，能得到最完全的分離。當色譜條件為(0.09mmol.L-1TAMOA)固定時，TAMOA與Ni()-acetate的比例為12或(21)時，立體拆分為最低，其結(jié)果不僅受配位添加劑SE和配位基SA分子影響，而且與流動相添加劑成分有關，特別與氨基離子和OH-有關。實際上,在CLEC色譜中，流動相添加劑可能形成

14、許多平衡式。Lam25描述了最簡單的立體選擇混合配位體形成的三齒配合物，金屬離子和兩個不同配位添加劑SE和拆分樣品SA形成的平衡形式。三元化合物的穩(wěn)定度可按下列公式表示:logK=2logSE-Me-SA-logSE-Me-SA-logSA-Me-SA三元混合物優(yōu)選形式，是由SE，Me，SA的濃度大小和logK值所描述，配位添加劑將不僅通過SE-Me-SE形成化合物所完成，而且也通過(D)-或(L)-SA分子完成，形成非對映體化合物。SE-M-(D)-SA和SE-M-(L)-SA結(jié)構(gòu)非常相似，其中間化合物可用結(jié)構(gòu)(J)表示。2已簡述了整個配位交換的過程，是將傳統(tǒng)的概念進行了延伸。表2TAMOA

15、(SE)的對映體選擇性與SE和金屬離子比例的關系(R,R)-()-TAMOA(mmol.L-1)(X)Ni()(mmol.L-1)(Y)o-Tyrm-Tyrp-TyrpheGlyST 1059k'LkDkLk'Dk'Lk'Dk'Lk'Dk'Lk'D0.91.8017.21.009.51.004.71.00010.71.000.90.9014.713.91.007 0.90.4511.31.006.81.003.21.004.85.71.

16、206.21.001.80.9031.01.0014.31.009011.811.21.052流動相添加劑中配位體離子交換機理模型由2可見，流動相中主要拆分樣品的濃度和手性添加劑（如TAMOA)都被吸附在固定相上，有廣泛均勻的分布，且有一定的保留時間。當TAMOA濃度增加時，在流動相中TAMOA限度由TAMOA-Me離子化合物的溶解度決定。它變化很明顯，TAMOAMe離子比為21時，光學選擇性的保留時間將比TAMOAMe為11時增加。因此，可以通過上述結(jié)果預測到，對于SA分子如果產(chǎn)生較多的立體位置，從而保留時間也會增加。早時我們注意到，如果一個配體(I)

17、與SE分子發(fā)生交換，保留時間就由被吸附在固定相上的大量化合物SE-Me-SE和SE-Me-I所決定，做一個相反的試驗，金屬離子的濃度為SE的兩倍時(TAMOAMe=12)，保留時間也增加，而且對應產(chǎn)生大量的SE-Me-SE和SE-Me-I，同時，SA以配合劑所保留，這樣I-Me-SA化合物的保留時間將雙倍增加，但并不是光學選擇。若I-Me-I化合物的穩(wěn)定常數(shù)將很低，無論I的濃度比SE的濃度高多少，僅有SE-Me-SE結(jié)構(gòu)存在，這種結(jié)果證實了產(chǎn)生了大量立體選擇的正確性，同時在立體選擇時還伴隨相對量較低的SE-Me-SE和/或SE-Me-I分子，假定化合物SE金屬離子為11時，其結(jié)果與Feibus

18、h et al26報道的一致。文獻報道了一個在CLEC固定相鍵合的新概念“稀鍵”(dilute bond)，這樣就避免了形成21化合物(SE-Me-SE)的形成，其結(jié)果是在優(yōu)化的光學選擇性和較高的柱效條件下獲得的，其中間配位體交換較SE配位體迅速。下面在光學體分離方面介紹采用配位體交換的機理，討論金屬離子配位劑。如果金屬離子存在，含有中心金屬配位劑的化合物將被洗脫出來。在CLEC體系中，流動相添加劑中洗脫劑和溶劑峰是非對映體SE-Me-(L)-SA和SE-Me-(D)-SA，若SE和I交換，則化合物I-Me-(L)-SA和I-Me-(D)-SA是與上述結(jié)果相一致。在相同的條件下，SE或I被SA

19、替換，相同的結(jié)構(gòu)(L-,D-)更適合于SA分子的構(gòu)型，其他異構(gòu)體的成分多少以色譜峰的大小體現(xiàn)。因此，形成L-SA-Me-(L)-SA化合物的峰，被(L)-pake所描述。無論如何，如果手性添加劑SE與主骨架形成共價鍵，可通過比較配位交換機理，使人們來認識光學體分離。因此，(L)-峰洗脫部分其 包括(L)-SE-Me-(L)-SA和I-Me-(L)-SA化合物的分子。SE和SA分子在親脂性體系中，可替換和相互交換，但是相對平衡。如果是這樣，SA可作為另一個SA的手性選擇者，形成SA-Me-SA化合物。采用含有非手性的SE分子流動相或結(jié)合到主骨架上，將(非等量D,L-)的手性的混合非消旋液進樣，易

20、受影響的同分異構(gòu)體(L-形式)作為手性選擇者，在這樣情況下，將形成下列混合配位體化合物：(1) (L)-SA-Me-(L)-SA，(2) (L)-SA-Me-(D)-SA和(3) (D)-SA-Me-(D)-SA其中(1)和(3)的結(jié)構(gòu)形成相互對映體，非消旋體的化合物結(jié)構(gòu)為(2)，在化合物穩(wěn)定常數(shù)和親脂性方面(2)和(1)(3)不同，后來結(jié)果中(L)-SA和(D)-SA都有可能存在，特別是當(D)-SA比(L)-SA量較小時，化合物(3)(D)-SA-Me-(D)-SA比化合物(1),(2)的量可以忽略不計。光學異構(gòu)體分離的概念是一般的稱法，由流動相中非對映分子形成與光學添加劑(SE)化合而成

21、。手性流動相添加劑技術在非水體系(non-aqueous systems)的研究Hara等人文獻27已報道，一般形成的非對映分子化合物，主要通過氫鍵力和極化極化作用力而形成。4拆分進展配位金屬離子交換色譜(Ligand metal exchange chromatography)通過溶質(zhì)配位體和金屬離子，將第二個配位體引入色譜體系，優(yōu)先選擇混合配位化合物，來影響分離效果。異構(gòu)體配位立體選擇溶液，通過體系的配位體是否具有光學活性和與金屬離子形成手性配合物來完成手性拆分。在手性拆分的研究工作中，配位金屬離子手性試劑已成為最活躍的一類手性選擇試劑，在CEC中也可鍵合到毛細管壁上。隨著人們對它和被分析

22、物結(jié)構(gòu)關系的進一步認識，實驗操作優(yōu)化分析方法的發(fā)展，許多文獻報道2835運用氨基酸及其衍生物進行手性配位體離子交換色譜的拆分，以及在其它分離模式中的運用。因此，可以預測，配位金屬離子手性添加劑必將在手性拆分的研究工作發(fā)揮更大的作用。)王榮，男，1969年2月生。理學碩士，主管藥師。王榮（中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）謝景文（中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）賈正平（中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）謝華（中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科甘肅蘭州730050）胡曉麗（中國人民解放軍蘭州軍區(qū)軍醫(yī)學院教務部甘肅蘭

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