植物的組織培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)一植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 植物組織培養(yǎng)是指植物的任何器官、 組織或細(xì)胞，在人工預(yù)知的控制條件下，放在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成的培養(yǎng)基中，使其生長(zhǎng)、分化并形成完整植株的過(guò)程。其理論依據(jù)是植物細(xì)胞具有全能性。 組織培養(yǎng)的特點(diǎn)是：組織培養(yǎng)的特點(diǎn)是：取材少，培養(yǎng)材料經(jīng)濟(jì)；人為控制培養(yǎng)條件，不受自然條件影響；生長(zhǎng)周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動(dòng)化控制。組織培養(yǎng)不但是進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、生物化學(xué)和藥物學(xué)等學(xué)科研究的重要手段；而且在農(nóng)學(xué)、園藝、林業(yè)和次生代謝產(chǎn)物工程等生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的主要部分培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的主要部分，除了培養(yǎng)材料本

2、身因素外，培養(yǎng)基的種類和成分等直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)和發(fā)育，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的種類和培養(yǎng)部位選擇適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的種類很多，不同的培養(yǎng)基有其不同的特點(diǎn)。培養(yǎng)基的主要成分：水無(wú)機(jī)成分：無(wú)機(jī)大量元素 氮： 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮混合 磷： 磷酸鹽 鉀： 鉀鹽 鈣、硫、鎂無(wú)機(jī)微量元素 主要有：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯有機(jī)成分： 糖、 維生素、肌醇、氨基酸及有機(jī)附加物。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 生長(zhǎng)素類：NAA、IAA、IBA、2,4-D 細(xì)胞分裂素類：BAP, KT，TDz，ZT 其他類： GA3, ABA， PP333瓊脂pH值 配制培養(yǎng)基最方便的方法是預(yù)先配制不同組分的培養(yǎng)基母液，貯藏在冰箱，待配制培

3、養(yǎng)基時(shí)取出，按比例稀釋。 配制母液時(shí)為了減少工作量可以把幾種藥品配在同一母液中，但是應(yīng)該注意各種化合物的組合以及加入的前后順序，應(yīng)該把鈣離子、錳離子、鋇離子和硫酸根和磷酸根例子錯(cuò)開(kāi)，以免發(fā)生沉淀。 把每種試劑單獨(dú)溶解后再加入后一種化合物。混合已溶解的各種礦質(zhì)鹽時(shí)還應(yīng)該注意加樣順序。 鐵鹽單獨(dú)配制，其配法為5.57g 的硫酸亞鐵（Fe SO4.7H2O）和7.45g乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）溶于1L水中，用時(shí)每配1L培養(yǎng)基，取該溶液5ml。 IAA 、IBA、NAA等可用少量的乙醇溶解，然后在加水定容。2,4-D可用1 N的Na OH 溶解然后再定容； KT和6-BA應(yīng)先定容于少量的1

4、 mol/L 的HCl中，再加水定容。玉米素應(yīng)該溶于95% 的乙醇中再定容。 pH值對(duì)培養(yǎng)基的凝固情況和植物材料的生長(zhǎng)有很大的影響，因此，等培養(yǎng)基配好后，應(yīng)該立即調(diào)整培養(yǎng)基的pH ,最好用酸度計(jì)，既快又準(zhǔn)。培養(yǎng)基配好后應(yīng)該立即分裝，體積一般為容器的 1/4 或者1/3為好。 器材和藥品器材和藥品 高壓蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺(tái)、循環(huán)水式真高壓蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺(tái)、循環(huán)水式真空泵、電子天平、酸度測(cè)定儀、光照培養(yǎng)箱空泵、電子天平、酸度測(cè)定儀、光照培養(yǎng)箱,搪搪瓷杯、搪瓷盤(pán)、瓷杯、搪瓷盤(pán)、100 ml三角燒瓶（三角燒瓶（12個(gè)個(gè)/組）、組）、250 ml三角瓶（三角瓶（2個(gè)個(gè)/組）、試劑瓶、解剖刀柄與組

5、）、試劑瓶、解剖刀柄與刀片、單面刀片、剪刀、長(zhǎng)鑷子、培養(yǎng)皿、移刀片、單面刀片、剪刀、長(zhǎng)鑷子、培養(yǎng)皿、移液管、漏斗、量筒、燒杯（液管、漏斗、量筒、燒杯（50、100、500、1000 m1），酒精燈、火柴、玻璃棒、吸耳球、），酒精燈、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮紙、線繩、牛皮筋、脫脂棉、封口薄膜、牛皮紙、線繩、牛皮筋、脫脂棉、濾紙、濾紙、pH試紙（試紙（5.4-7.0）、標(biāo)簽紙、稱量紙、）、標(biāo)簽紙、稱量紙、藥勺等。藥勺等。 次氯酸鈉消毒液次氯酸鈉消毒液, 75%的酒精的酒精 ,0.2的升汞溶液的升汞溶液. 1 N 鹽酸鹽酸,1 N NaOH,0.8%的瓊脂的瓊脂,3%的蔗糖的蔗糖. 0.

6、1 mg/ml的的2,4-D溶液溶液：取25 mg的 2,4-D，加入少量95%的酒精和1 N的NaOH溶解，再加蒸餾水定容至250 ml。 0.1 mg/ml 的的6-BA溶液溶液：取25 mg的6-BA，用少量1 N的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至250 ml。表.1 MS培養(yǎng)基儲(chǔ)備液的配制培養(yǎng)基儲(chǔ)備液的配制實(shí)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟P培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制11母液配制：母液配制： 按照表 1分別配制，并在4 冰箱中保存。22. 植物激素配制植物激素配制：稱取10 mg NAA,加入少量酒精，并加水定容50 ml (濃度為0.2 mg/ml), 用同樣的方法配制2，4-D母液。 稱取 50 mg 6

7、-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至50 ml (濃度為1 mg/ml) 。4 3MS基本培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基的配制：分別吸取MS貯備液30.0 ml（大量元素）、3.0 ml微量元素、 3.0 ml鐵鹽、 3.0 ml有機(jī), 加入1 L的搪瓷缸中，然后稱取蔗糖18.0g, 加入瓊脂4.8g，加蒸餾水約550 ml，在電爐上加熱，煮沸，融化瓊脂，然后加水至560ml。4. 不同激素濃度培養(yǎng)基的配制不同激素濃度培養(yǎng)基的配制：取200ml燒杯3個(gè)，分別吸取所需要的2,4-D溶液(0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 所需要的體積為：1.0，2.0, 4.0ml

8、)，然后加入MS基本培養(yǎng)190ml，攪拌均勻后，用10%的NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8。 加水定容至200ml。5. 將配制好的培養(yǎng)基分裝于50ml三角瓶中，蓋上封口膜，并用牛皮紙包扎。 操培養(yǎng)基滅菌11. 打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水。22.加水后，將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，不要放的太多，以免影響滅菌效果。物品不要近靠鍋壁，以免冷凝水順壁流入物品中。33. 加蓋旋緊螺旋。44. 打開(kāi)放汽閥，加熱，自開(kāi)始產(chǎn)生蒸汽后5分鐘，再關(guān)緊放汽閥，此時(shí)鍋內(nèi)的冷空氣已由排氣孔排盡，讓溫度隨蒸汽壓力的增高而上升。5 5. 待壓力逐漸上升到所需壓力時(shí)（待壓力逐漸上升到所需壓力時(shí)（一般為一般為15磅磅/時(shí)，時(shí)， 1.034

9、10 5Pa）, 滅菌滅菌20分鐘。分鐘。6 滅菌后，滅菌后，待壓力降至待壓力降至0時(shí)，時(shí)，開(kāi)蓋，取出滅菌物品。開(kāi)蓋，取出滅菌物品。（在壓力未完全下降前，切勿打開(kāi)鍋蓋）。（在壓力未完全下降前，切勿打開(kāi)鍋蓋）。胡蘿卜組織培養(yǎng)胡蘿卜組織培養(yǎng)1. 取兩個(gè)50ml的小燒杯,分別倒入25ml的70%的酒精和0.2%的升汞。2. 取胡蘿卜貯藏根，洗凈，然后將胡蘿卜根于70酒精中浸泡數(shù)秒鐘。 3. 浸于0.2氯化汞（升汞）液中消毒滅菌10 min后,再用無(wú)菌水沖洗34次。4. 將滅菌材料放在滅菌的濾紙上,吸干水分。5. 用解剖刀將胡蘿卜切去表皮和中柱，取皮層，切成0.5cm見(jiàn)方的小塊，接種于MS附加 2.0

10、mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基內(nèi),于 25，黑暗或漫射光下培養(yǎng),1421 天后繼代一次。水稻成熟胚組織培養(yǎng)水稻成熟胚組織培養(yǎng)1. 取成熟種子，用 70乙醇浸l min，轉(zhuǎn)至l.5次氯酸鈉溶液（ 含有0.01%吐溫20）浸泡l.52 h后，用無(wú)菌水沖洗45次，置無(wú)菌濾紙上吸干多余水分。2. 將成熟胚置于含 2 mgL 2，4D的 MS固體培養(yǎng)基上，27 暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織 10天后（成熟胚）繼代一次。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：配制培養(yǎng)基時(shí)，一定要注意調(diào)節(jié)配制培養(yǎng)基時(shí)，一定要注意調(diào)節(jié)pH。2.外植體不能太小，否則會(huì)影響愈傷組織的形成。外植體不能太小，否則會(huì)影響愈傷組織的形成。結(jié)果結(jié)果 外植體經(jīng)過(guò)外植體經(jīng)

11、過(guò)20天的培養(yǎng)后，長(zhǎng)出淡黃色的愈傷天的培養(yǎng)后，長(zhǎng)出淡黃色的愈傷組織。組織。花卉組培苗產(chǎn)業(yè)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀與前景化現(xiàn)狀與前景緒論 當(dāng)今，植物生物技術(shù)已發(fā)展成為新技術(shù)革命的重要組成部分，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園林等領(lǐng)域運(yùn)用生物技術(shù)收到了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，其中組織培養(yǎng)工廠化育苗是運(yùn)用最廣、效果最好的一項(xiàng)。組織培養(yǎng)快速繁殖種苗，具有無(wú)性繁殖的特點(diǎn)，能較好地保持原種的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀，繁殖系數(shù)高，便于工廠化生產(chǎn)和集約化經(jīng)營(yíng)，以組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)為手段建立某種或某類植物商業(yè)性地生產(chǎn)體系，被譽(yù)為最具有開(kāi)發(fā)前景地種苗產(chǎn)業(yè)。一、國(guó)內(nèi)外花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)、國(guó)內(nèi)外花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展動(dòng)態(tài)展動(dòng)態(tài)1.1國(guó)外花卉組培苗

12、產(chǎn)業(yè)化概況 1960年法國(guó)的莫瑞爾（Morel）建立的蘭花組培苗工廠，標(biāo)志著世界上第一家花卉組培苗實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn). 進(jìn)入80年代以后，花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)得到了較快的發(fā)展。據(jù)歐洲及地中海植物保護(hù)組織（EPPO）1991年公報(bào)，僅西歐國(guó)家目前共擁有248家植物繁殖公司，其中從事花卉組培苗生產(chǎn)的占有較大的比重。1.2國(guó)內(nèi)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化概況國(guó)內(nèi)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化概況 在我國(guó)農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園林等領(lǐng)域里，國(guó)家級(jí)、省級(jí)、甚至市級(jí)、縣級(jí)的科研單位、大專院校等幾乎都擁有植物組培的實(shí)驗(yàn)室或繁殖中心或育苗工廠或育苗公司 廣州花卉研究中心工廠化生產(chǎn)蔭生觀葉植物組培苗年產(chǎn)量達(dá)千萬(wàn)株以上 浙江亞林所已大量培養(yǎng)唐菖蒲脫毒苗

13、 上海多個(gè)科研院所或生產(chǎn)單位培育的香石竹、勿忘我、扶郎花等組培苗已大批量地推上市場(chǎng)，有的還外銷，年產(chǎn)量達(dá)100萬(wàn)株以上 上海交大昂立天然藥物工程技術(shù)有限公司目前已開(kāi)展了鐵皮石斛新采集野生蒴果的組織培養(yǎng)工作。組培苗長(zhǎng)勢(shì)良好，預(yù)計(jì)年底可生產(chǎn)100萬(wàn)株苗，并完成10 畝大田的移栽工作。明年即可得到人工栽培的瀕危珍稀藥材鐵皮楓斗。 鐵皮石斛組培苗鐵皮石斛組培苗二、我國(guó)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀 我國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工作者對(duì)3000多種植物進(jìn)行了組培最佳培養(yǎng)基的篩選工作,但真正應(yīng)用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的組培植物主要是果樹(shù)類作物及一些經(jīng)濟(jì)作物,全國(guó)已建成葡萄、蘋(píng)果、香蕉、馬鈴薯、甘蔗等快繁生產(chǎn)線11條,供應(yīng)試管苗達(dá)幾千萬(wàn)

14、株,生產(chǎn)的香蕉已進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。 目前花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展較快的主要有香石竹、百合、大花惠蘭、馬蹄蓮的組培苗也在向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展,但規(guī)模較小。三、我國(guó)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化存在存在問(wèn)題問(wèn)題1、培養(yǎng)程序過(guò)于繁瑣、培養(yǎng)程序過(guò)于繁瑣,成本高成本高,科研成果不科研成果不易向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展易向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展 唐菖蒲用花蕾外植體建立脫毒苗后,需分別繼代于分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基,分化培養(yǎng)基中必須附加NAA、6-BA和腺嘌呤,生根培養(yǎng)基中須附加IBA,培養(yǎng)周期為65天左右。 脫毒微型薯在基本MS培養(yǎng)基中既能生長(zhǎng)莖葉又能生根,不需要外加激素,培養(yǎng)周期為20天左右,生產(chǎn)工藝程序簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低。 這就是脫毒微型薯組培容易

15、形成產(chǎn)業(yè)化,而蘭花、唐菖蒲等花卉不易形成產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的原因之一。 2、同一種花卉不同屬、不同品種所、同一種花卉不同屬、不同品種所用培養(yǎng)基不相同用培養(yǎng)基不相同,重現(xiàn)性差重現(xiàn)性差 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)卡特利亞蘭組培苗的研究： 美國(guó)學(xué)者認(rèn)為卡特利亞蘭莖尖或只帶一對(duì)葉原基的莖尖分生組織在Knudsonc附加100mgL-1椰奶液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果最佳。 中國(guó)學(xué)者認(rèn)為MS附加6-BA5mgL- 1,NAA0.1mgL-1固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖效果最佳。 其他學(xué)者也做過(guò)這方面研究,結(jié)果不盡相同 。 歸結(jié)原因主要是不同品種的外植體培養(yǎng)方法不同,重現(xiàn)性差 。3、組培苗移栽成活率差、開(kāi)花難、組培苗移栽成活率差、開(kāi)花難 天津

16、綠化研究所成功地研究出大花惠蘭組培苗培養(yǎng)基配方和小苗的移栽方法,但對(duì)大花惠蘭的開(kāi)花生理沒(méi)有完全了解,栽培方法掌握不好,成苗后不能開(kāi)花,他們與南韓合作,所生產(chǎn)的組培盆栽成活后,由韓國(guó)栽培開(kāi)花。 4、花卉市場(chǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)不良是阻礙花卉組、花卉市場(chǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)不良是阻礙花卉組培產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要原因培產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要原因 不僅農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展受到市場(chǎng)的限制,其它高科技發(fā)展和推廣同樣受到市場(chǎng)的挑戰(zhàn)。這給我們科技工作者提出了怎樣以市場(chǎng)為導(dǎo)向,努力探索加快我國(guó)現(xiàn)有生物技術(shù)成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力,并使產(chǎn)業(yè)形成一定規(guī)模的新途徑。四、我國(guó)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展四、我國(guó)花卉組培苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景及建議前景及建議1、簡(jiǎn)化培養(yǎng)程序,降低生產(chǎn)成本,形成產(chǎn)業(yè)化配套體系 盡可能探索一次性成苗的最佳培養(yǎng)基配方,減少移苗次數(shù),縮短培養(yǎng)周期 盡量減少生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的種類和用量,簡(jiǎn)化操作程序 掌握從準(zhǔn)備制備培養(yǎng)基分裝滅菌接種培養(yǎng)移栽的一整套簡(jiǎn)化程序的工藝流程 盡量增加每瓶接苗數(shù),降低生產(chǎn)成本 2、增加收入,有計(jì)劃地采用先進(jìn)設(shè)備和技術(shù) 荷蘭在短短幾十年內(nèi)成為馳名世界的“花卉王國(guó)”的經(jīng)驗(yàn)之一就是他們重視選育良種,采用技術(shù)先進(jìn)、系列配套的設(shè)施以及普遍推廣高新技術(shù) 目前我國(guó)花卉組培種苗的培育規(guī)模比較小,為了促進(jìn)花卉業(yè)的發(fā)展,應(yīng)適當(dāng)增加投入