制備型高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)方法_陳明杰

1、第 10卷 第 4期 2012年 8月 實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)Experiment Science and Technology Vol. 10No. 4Aug. 2012制備型高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)方法陳明杰 , 危鳳(浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程分院 , 浙江寧波 315100 收稿日期 :20110930; 修改日期 :20120220基金項(xiàng)目 :寧 波 市 生 物 醫(yī)藥 應(yīng) 用 型 專(zhuān)業(yè) 人 才 培 養(yǎng)基 地 研究項(xiàng)目 (Jd070201 。 作者簡(jiǎn)介 :陳明杰 (1982 , 男 , 本科 , 實(shí)驗(yàn) 師 , 主要 從事 天然 產(chǎn) 物 分 離 的研究 與 應(yīng) 用 。摘要 :制 備型 高 效液

2、 相色譜已 廣 泛 應(yīng) 用于 醫(yī)藥 、 精 細(xì) 化 工 、 食品 等 行 業(yè) , 特 別 適 用于 分 離 高 附 加 值 、 高 純 度 的 產(chǎn) 品 。 通 過(guò) 制 備型 高 效液 相色譜 分 離 生 育 酚 各 組 分 的 教學(xué)實(shí) 踐 , 探 討 了制 備型 高 效液 相色譜 實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi) 容 的 設(shè) 置 , 以 及 通 過(guò) 實(shí)驗(yàn)教學(xué) 提 高學(xué) 生 獨(dú) 立 分析和 解 決 問(wèn)題 能 力 的 方 法 , 強(qiáng)化 了 學(xué) 生 的 應(yīng) 用 能 力 。 關(guān) 鍵 詞 :制 備型 高 效液 相色譜 ; 實(shí)驗(yàn)教學(xué) ; 生 育 酚 ; 方 法中圖分類(lèi)號(hào) :O658. 1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼 :Adoi :10396

3、9/jissn16724550201204009Exploration on Experiment Teaching of Preparative HighPerformance Liquid ChromatographyCHEN Ming-jie , WEI Feng(Ningbo Institute of Technology , Zhejiang University , Ningbo 315100, China Abstract :Preparative high performance liquid chromatography has been widely applied in

4、medicine , fine chemical and food , particu-larly applicable to separate high added value and high purity products. This paper introduced the experiment teaching of preparative high performance liquid chromatography in separation of tocopherol , explored how to set up teaching content , and the ways

5、 of improving students abilities to analyze and solve problems. The studentsapplication abilities were strengthened. Key words :preparative high performance liquid chromatography ; experiment ; tocopherol ; method制備型高效液相色譜并非分析色譜的簡(jiǎn)單放 大 , 兩者有許多不同 。 分析色譜需要全面地反映樣 品組成的信息 , 而不必收集特定組分 ; 而制備色譜 主要考察目標(biāo)產(chǎn)物的純度 、

6、 產(chǎn)量 、 生產(chǎn)周期 、 生產(chǎn) 成本等12。生育酚又稱(chēng)維生素 E , 是最主要的抗氧化劑 之一 。 它能促進(jìn)性激素分泌 , 使男子精子活力和 數(shù)量增加 ; 使女子雌性激素濃度增高 , 提高生育 能力 , 預(yù)防流產(chǎn) 。 它廣泛用于醫(yī)藥保健品 、 食品 、 化妝品等行業(yè) 35, 是一種極具市場(chǎng)前景的熱門(mén)產(chǎn)品 。目前很多高校都開(kāi)設(shè)了高效液相色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué) , 也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的研究67, 但關(guān)于制備型 高效液相色譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)的研究未見(jiàn)報(bào)道 。1采用外標(biāo)法測(cè)定生育酚各組分的含量1. 1儀器與試劑分析液相色譜儀 (K 501泵 , K2501紫外檢測(cè)器 , 手動(dòng) 進(jìn) 樣 , 進(jìn) 樣 體 積 20L , 購(gòu)

7、自 德 國(guó)KNAUER 公司 ; 分析型色譜柱 (150mm 4. 6mm , 5m 購(gòu)自大連伊利特 ; SB3200超聲波清洗機(jī)購(gòu) 自寧波新芝生物科技公司 。甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán) ; 原料97的生育酚購(gòu)自 九三油脂公司 ; 以此原料制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 1. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(1 分 別 稱(chēng) 取97生 育 總 酚 0. 0090g 、0. 0220g 、 0. 0380g 、 0. 0510g 、 0. 0800g 、 0. 1060g 、 0. 1415g 、 0. 1768g 、 0. 2198g 定 容于 10mL 容 量 瓶 , 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 進(jìn) 行 HPLC 分 析 。(2 色譜條件

8、 :色譜柱為 ODS 分析柱 (150mm 4. 6mm , 5m , 填料為 Hypersil , 流動(dòng)相為甲醇 , 流速 0. 8mL ·min 1, 檢測(cè)波長(zhǎng) 292nm 。(3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 :以生育酚總酚的峰面積為橫坐 標(biāo) , 濃度 C (g ·L 1為縱坐標(biāo) , 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 進(jìn) 行回歸分析 , 結(jié)果如表 1所示 。1. 3原料生育酚中各組分含量測(cè)定(1 將 100g ·L 1的 生 育 酚 原 料 進(jìn) 料 液 稀釋至 50g ·L 1, 使各組分的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的 測(cè)定范圍內(nèi)測(cè)定97生 育 酚 原 料 中 各 組 分 的 含量 。 實(shí)驗(yàn)科學(xué)

9、與技術(shù) 2012年 8月表 1生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線考察結(jié)果C /(g ·L 10. 902. 203. 805. 108. 0010. 6014. 1517. 6821. 98A 27. 1975. 40130. 58178. 70274. 63354. 79458. 42558. 86677. 14回歸方程Y =0. 01746X1.094(n =9 , R 2=0. 9995 (2 進(jìn)樣分析 , 重復(fù) 3次 , 記錄生育酚各組分 的峰面積 , 并計(jì)算生育酚中各組分的平均含量 。 實(shí) 驗(yàn)結(jié)果如表 2、 圖 1所示 。表 2生育酚各組分含量測(cè)定結(jié)果組分名稱(chēng) 生育酚 (+ 生育酚 生育酚 雜

10、質(zhì) 平均含量/42. 5252. 002. 483. 00 2制備型高效液相色譜分離生育酚各組分2. 1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵苽湫透咝б合嗌V分離的基本原理 ; 區(qū)分制備型高效液相色譜和分析型高效液相色譜的共 同點(diǎn)和不同點(diǎn) 。 2. 2儀器與試劑半制備液相色譜儀 (K 501泵 , K2501紫外檢 測(cè)器 , 手 動(dòng) 進(jìn) 樣 , 進(jìn) 樣 體 積 1mL , 購(gòu) 自 德 國(guó) KNAUER 公 司 ; 半 制 備 型 色 譜 柱 (100mm 10mm , 20m 購(gòu)自大連伊利特 ; SB3200超聲波清洗 機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技公司 。甲醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán) ; 原料是97的混合生育 酚 , 購(gòu)自九三油脂公司

11、 。 2. 3實(shí)驗(yàn)步驟 2. 3. 1配 置 溶液(1 進(jìn)料原料的配置 。 準(zhǔn)確稱(chēng)取 10g 生育酚原料 ,用甲醇定容于 100mL 容量瓶中 , 濃度為 100g ·L 1。 (2 流動(dòng)相的配置 。 為減少流動(dòng)相后續(xù)回收的 難度 , 本實(shí)驗(yàn)直接以甲醇為流動(dòng)相 。 2. 3. 2生 育 酚 各 組 分 流 分 切割 與 循 環(huán)進(jìn) 樣(1 操作條件 :色譜柱為 ODS 分析柱 (100mm 10mm , 20m , 填料為 Hypersil , 流動(dòng)相為甲醇 , 流速 2mL ·min 1, 進(jìn)樣體積為 1mL , 檢測(cè)波 長(zhǎng) 292nm 。(2 流分切割與循環(huán)進(jìn)樣 :為提高

12、制備色譜的 生產(chǎn)強(qiáng)度 , 降低生產(chǎn)成本 , 需增加樣品濃度或體積 , 使用大粒徑填料 。 這些措施均會(huì)降低分離效果 , 以 致各組分洗脫峰重疊 。 此時(shí)需采用流分切割和循環(huán) 進(jìn)樣技術(shù)來(lái)提高產(chǎn)品純度 。 在圖 1中 , 組分 3未得 到基線分離 , 其重疊部分 2可作為樣品再行分離。圖 1生育酚各組分的流分切割與循環(huán)進(jìn)樣2. 3. 3產(chǎn) 品 分析(1 安裝分析型色譜柱 , 按儀器操作說(shuō)明依次 打開(kāi)色譜各單元 。(2 色譜條件 :色譜柱為 ODS 分析柱 (150mm 4. 6mm , 5m , 填料為 Hypersil , 流動(dòng)相為甲醇 , 流速 0. 8mL ·min 1, 檢測(cè)波長(zhǎng)

13、 292nm 。(3 分別進(jìn)樣 20L , 得到各組分的保留時(shí)間 和峰面積 。 2. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. 4. 1制 備 色譜 生 產(chǎn) 效 率 的 考 察制備色譜和分析色譜的最大不同是制備色譜主 要考察目標(biāo)產(chǎn)物的純度 、 產(chǎn)量 、 生產(chǎn)周期 、 生產(chǎn)成 本等 。 我們通過(guò)制備色譜實(shí)驗(yàn)使學(xué)生深刻了解制備 色譜的特點(diǎn) , 使理論知識(shí)和生產(chǎn)實(shí)際相結(jié)合 , 培養(yǎng) 學(xué)生在實(shí)際中解決問(wèn)題的能力 。 而在實(shí)驗(yàn)后 , 學(xué)生 需要通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理得到本次制備色譜實(shí)驗(yàn) 目標(biāo)產(chǎn)物的純度 Pu 、 產(chǎn)率 Pr 、 回收率 Re 和溶劑消 耗 Sc 。 這 4個(gè)指標(biāo)可分別按式 (1 (4 計(jì)算 。Pu =C i , j

14、 nj =1C i , j(1Pr =V i · n j =1C i , j V col ·T cyc (2 Re =V i ·C i , j V Feed ·C Feed , j (3 Sc =F ·T cyc Vi · nj =1C i , j(4·42·第 10卷 第 4期 陳明杰 , 等 :制備型高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)方法 表示收集產(chǎn)品 i 的體積 ; nj =1Ci , j表示收集產(chǎn)品 i 的總濃度 ; V col 表示柱子體積 ; T cyc 表示進(jìn)樣周期 ; V Feed表示進(jìn)樣體積 ; C Feed ,

15、 j 表示進(jìn)樣原料中目標(biāo)產(chǎn)物 j 的濃度 ; F 表示制備色譜流動(dòng)相的速率 。2. 4. 2收 集 產(chǎn) 品 的 分析實(shí)驗(yàn)中對(duì)原料進(jìn)行了 4次切割收集了 1、 2、 3共 3個(gè)流分 , 如圖 1所示 , 由于原料中主要含有 生育酚和 (+ 生育酚 , 而 生育酚較少 ,為了方便起見(jiàn) , 我們只收集 2個(gè)產(chǎn)品 。 分別為 1號(hào)流分主要為 生育酚 (記為產(chǎn)品 1 , 2號(hào)流分為生育酚和 (+ 生育酚混合部分 (作為混合部分下次做進(jìn)樣原料用 , 3號(hào)流分主要為 (+ 生育酚 (記為產(chǎn)品 2 。 實(shí)驗(yàn)中制備柱體積Vcol=7. 85mL , 進(jìn)樣體積 VFeed=1mL , 進(jìn)樣周期Tcyc=7. 5m

16、in , 進(jìn)料濃度 CFeed=50g ·L 1, 流動(dòng)相速率 F =2mL ·min 1=0. 12L ·h 1。 數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表 3所示 , 產(chǎn)品色譜圖分別如圖 2、 圖 3所示 。表 3制備色譜考察結(jié)果產(chǎn)品組分含量/1雜質(zhì) 生育酚1. 598. 52(+ 生育酚生育酚96. 04. 0純度 /98. 5100. 0產(chǎn)率 /(g ·L 1·h 167. 246. 3回收率 /92. 395. 2溶劑消耗/L·g 10. 240. 352. 4. 3結(jié) 果 分析 與 討 論用甲醇做流動(dòng)相的反相制備型高效液相色譜分離生育酚實(shí)驗(yàn)中 ,

17、 除了 生育酚和 生育酚不能分離外 , 其他各組分能做到較好的分離 。 為了方便學(xué)生實(shí)驗(yàn) , 實(shí)驗(yàn)中只收集 2個(gè)產(chǎn)品 , 即 生育酚和 (+ 生育酚 。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 , 2種產(chǎn)品的純度分別達(dá)到了 98. 5和 100, 而回收率分別達(dá)到 92. 3和 95. 2, 結(jié)果良好 。 通過(guò)實(shí)驗(yàn) ,學(xué)生掌握了制備型高效液相色譜的基本原理 , 區(qū)分了高效液相色譜和制備型高效液相色譜的不同點(diǎn) ,達(dá)到了較好的教學(xué)效果 。圖 2產(chǎn)品 1色譜圖圖 3產(chǎn)品 2色譜圖3結(jié)束語(yǔ)制備型高效液相色譜作為一種高效的分離和純 化技術(shù) , 在醫(yī)藥 、 精細(xì)化工 、 食品等行業(yè)應(yīng)用非常 廣泛 。 作為醫(yī)藥方面的工科類(lèi)院校 , 在高效液相色 譜實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基礎(chǔ)上開(kāi)設(shè)制備型高效液相色譜實(shí)驗(yàn) 教學(xué)是非常必要的 。 這有助于學(xué)生識(shí)別制備型高效 液相色譜和高效液相色譜的共同點(diǎn)和不同點(diǎn) , 把理 論知識(shí)和生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合 , 培養(yǎng)學(xué)生實(shí)際應(yīng)用的能 力 。 隨著我校實(shí)踐教學(xué)體系的開(kāi)展 , 教師也在嘗試 如何將自己較成熟的科研項(xiàng)目引用到教學(xué)實(shí)驗(yàn)中 , 以便更好地培養(yǎng)學(xué)生的科研 、 實(shí)踐能力 。參 考 文 獻(xiàn)1霍斯泰特曼 , 馬斯頓 . 制備色譜技術(shù) 在天然產(chǎn)物 分離中的應(yīng)用 M . 趙維民 , 張?zhí)煊?, 譯 . 北京 :北 京科學(xué)出版社 , 2000. 1015.2劉望才 , 楊京芬 , 朱家文