利用光學(xué)多通道分析儀與分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的紫外_可見光區(qū)吸收光譜

1、物理實(shí)驗(yàn)第25卷第12期PHYSICSEXPERIMENTATION2005年12月Vol.25No.12Dec.,2005利用光學(xué)多通道分析儀與分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的紫外2可見光區(qū)吸收光譜劉暢,王世才,盧東昱(中山大學(xué)物理學(xué)系,廣東廣州510275)摘要:應(yīng)用分析化學(xué)中常用的吸光光度法,通過光學(xué)多通道分析儀和紫外2可見分光光度計(jì)對(duì)葉綠素提取液和葉綠素晶體分別進(jìn)行了紫外2可見光區(qū)吸收光譜的探測(cè),并對(duì)其吸收曲線進(jìn)行了分析和研究.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)文獻(xiàn)中的一些數(shù)據(jù)進(jìn)行了討論.關(guān)鍵詞:吸光光度法;葉綠素;紫外2可見吸收光譜中圖分類號(hào):O433.51文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100524642(2005)1

2、2200382041引言.實(shí)驗(yàn)時(shí),測(cè),以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)作圖,得到該物質(zhì)的光吸收曲線.實(shí)驗(yàn)證明,溶液對(duì)光的吸收程度與溶液濃度、液層厚度及入射光波長(zhǎng)等因素有關(guān).Lambert和Beer分別于1760年和1852年研究了光的吸收與液層厚度及溶液濃度的定量關(guān)系,二者合稱Lambert2Beer定律1.平面光波在各向同性的均勻媒質(zhì)(溶液)中傳播,定義A=ln(I0/I)為吸光度,其中I0和I分別是入射光和出射光的光強(qiáng)(I=I0e-Cl),則Beer定律的另一數(shù)學(xué)形式為:A=Cl,其中為常數(shù),2C為溶液濃度,l是樣品的厚度.當(dāng)溶液濃度很大時(shí),分子間的相互影響不可忽略,Beer定律不成立.有機(jī)

3、化合物的紫外2可見吸收光譜,是化合物中外層電子(包括成鍵電子和非成鍵電子)躍遷的結(jié)果,故又稱電子吸收光譜3,4.光合作用是地球上最重要的生物化學(xué)反應(yīng),其作用是吸收太陽輻射并將其轉(zhuǎn)化成綠色植物的生物能.太陽光在可見光區(qū)的強(qiáng)度最大(對(duì)應(yīng)于6000K黑體輻射的強(qiáng)度峰值),經(jīng)過漫長(zhǎng)的自然選擇,作為光合作用.本文a和b晶體的,并對(duì)其吸收曲線進(jìn)行了分析和研究.2實(shí)驗(yàn)儀器簡(jiǎn)介WGD26型光學(xué)多通道分析儀2由光柵單色儀、CCD接收單元、掃描系統(tǒng)、電子放大器、A/D采集單元和計(jì)算機(jī)組成,如圖1所示.入射狹縫、出射狹縫均為直狹縫,寬度范圍為02mm連續(xù)可調(diào).溴鎢燈光源發(fā)出的光束通過寬度為10mmM1.反射鏡M2.

4、準(zhǔn)光鏡M3.物鏡M4.轉(zhuǎn)鏡G.平面衍射光柵S1.入射狹縫S2.CCD接收位置S3.觀察窗或出射狹縫圖1WGD26型光學(xué)多通道分析儀原理示意圖收稿日期:2005203222;修改日期:2005208211資助項(xiàng)目:國(guó)家理科人才培養(yǎng)基地資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介:劉暢(1982-),男,廣東廣州人,中山大學(xué)物理學(xué)系2002級(jí)物理學(xué)專業(yè)本科生.通訊聯(lián)系人:盧東昱(1980-),男,廣東揭陽人,中山大學(xué)碩士研究生.© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期劉暢,等:利

5、用光學(xué)多通道分析儀與分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的紫外2可見光區(qū)吸收光譜表1光合色素在有機(jī)溶劑中的吸收峰位置葉綠素種類葉綠素a葉綠素b2胡蘿卜素2胡蘿卜素葉黃素峰值/nm420,660435,643420,440,470425,450,480425,445,47539(l=10mm)的有機(jī)玻璃比色皿吸收池,進(jìn)入入射狹縫S1,通過M1反射的光束經(jīng)M2反射后成為平行光束投向光柵攝譜儀G.光柵攝譜儀采用反射式平面閃爍光柵作色散元件,拍攝原子或分子光譜.經(jīng)G衍射后的平行光束經(jīng)物鏡M3成像在S2上.M2和M3鏡焦距均為302.5mm,光柵G每毫米刻線600條,閃耀波長(zhǎng)550nm.3檢測(cè)步驟與樣品制備1)用汞燈的

6、發(fā)射光譜對(duì)光學(xué)多道分析儀定丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式5如下Ca=12.21A663-2.81A646Cb=20.13A646-5.03A663CT=Ca+Cb=17.32A646-7.A663CX.C=(000A470-3.aCb)/229標(biāo).用以定標(biāo)的汞燈發(fā)射譜線數(shù)據(jù)如下:紅光區(qū)的定標(biāo)起始波長(zhǎng)為574nm,定標(biāo)發(fā)射譜線分別是576.96nm,578.97nm和730.96nm;藍(lán)紫光區(qū)的定標(biāo)起始波長(zhǎng)為400nm,定標(biāo)發(fā)射譜線分別是404.67nm,435.83nm和546.07nm.2),吸收光譜的測(cè)量(6析儀).其葉綠素的提取方法是5:a.取新鮮的、洗凈擦干的黃連翹葉片0.5g,去中脈,

7、剪碎后放入研缽中,加石英砂和碳酸鈣粉(少量)及23mL80%丙酮(或95%乙醇),冰浴中研磨至組織變白,再加丙酮10mL,研成勻漿,暗處靜置約10min.b.將提取液過濾到50mL棕色容量瓶(或替代物)中,用丙酮反復(fù)沖洗研缽與研棒數(shù)次,并用少量丙酮反復(fù)沖洗濾紙和殘?jiān)?直至無綠色為止,以使色素全部轉(zhuǎn)移入容量瓶.最后用丙酮定容至50mL,搖勻,保存于暗處備用.在進(jìn)行光度測(cè)量時(shí),使用參比溶液可以消除由于吸收池壁及溶劑對(duì)入射光的反射和吸收帶來的誤差,并扣除干擾的影響.作為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn),我們不采用顯色劑,故參比溶液采用含有與待測(cè)溶液相同摩爾濃度溶劑的無色溶液1.3)把葉綠素晶體溶解在丙酮溶液中,對(duì)此溶液進(jìn)行

8、吸收光譜的測(cè)量,比較所得結(jié)果(使用TU21800SPC型紫外2可見分光光度計(jì)).(1)a,Cb,T和b,-1CL-1;A663,A646,A470分別663nm,646nm,470nm下的吸光度.1)探測(cè)葉綠素提取液在整個(gè)可見光波段的吸收曲線(使用WGD26型光學(xué)多通道分析儀)探測(cè)的結(jié)果見圖2,圖中縱坐標(biāo)值的計(jì)算公式為(適用于圖24).y=100A=100ln,即A=ln)I(I()是入射光通過80%丙酮溶液后的光強(qiáng)式中I0()是入射光通過葉綠素丙酮溶液后的光強(qiáng)值,I(值,A是葉綠素在該波長(zhǎng)的吸光度.由圖2可得出,在紅光區(qū),吸收峰位于662.1nm處,該處的吸光度為A662=0.741.藍(lán)紫光

9、區(qū)的吸收峰有3個(gè):442.0nm,458.6nm和474.5nm,其中以474.5nm的吸光度最大,為4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論各種光合色素在有機(jī)溶劑(包括80%丙酮溶液)中的吸收峰位置3如表1所示.圖2葉綠素提取液在可見光區(qū)(380740nm)的吸收光譜© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 40物理實(shí)驗(yàn)第25卷A474.5=0.574.(表示2次測(cè)量值的平均數(shù))對(duì)照表1和式(1)的精確測(cè)量峰值表及各種葉綠素含量的計(jì)算公式,筆者認(rèn)為:a.實(shí)測(cè)的662nm強(qiáng)吸收峰正

10、是葉綠素a在660nm3(或663nm5)的吸收峰,葉綠素b在643nm3(或646nm5)的吸收峰在被測(cè)溶液中沒有被測(cè)量到.b.吸收峰442.0nm,458.6nm,474.5nm有可能是2胡蘿卜素、2胡蘿卜素和葉黃素吸收峰累加后的結(jié)果,其中442.0nm,474.5nm兩峰與2胡蘿卜素的440nm,470nm3和葉黃素的445nm,475nm3峰值比較一致.c.由式(1)計(jì)算,實(shí)驗(yàn)用的黃連翹葉子的色素(a)紅光區(qū)(580730nm)含量如表2所示.表2mg/L-濃度CaCTCX.C7.3.3911.140.74(b)藍(lán)紫光區(qū)(350500nm)注:葉綠素a和b的含量比約為73.圖3葉綠素提

11、取液的分濃度吸收光譜2)探測(cè)不同濃度的葉綠素提取液在吸收峰附近的吸收曲線(使用WGD26型光學(xué)多通道分析儀)為了測(cè)出葉綠素提取液的濃度對(duì)吸收峰的影響,對(duì)不同濃度的葉綠素提取液在吸收峰附近的吸收曲線進(jìn)行了探測(cè).假設(shè)提取液的起始濃度為100%,然后采用逐次稀釋的方法測(cè)出濃度為50%,25%,10%時(shí)溶液的吸收曲線.測(cè)得的2個(gè)主要吸收峰(662nm和436nm)的吸光度隨濃度變化的曲線見圖3.可以看出,溶液的濃度對(duì)吸收峰的波長(zhǎng)幾乎沒有影響,光的吸收與溶液濃度的關(guān)系遵從Lambert2Beer定律.3)探測(cè)葉綠素晶體在可見光與近紫外光區(qū)的吸收曲線(使用TU21800SPC型紫外2可見分光光度計(jì))為了將

12、實(shí)驗(yàn)所得的曲線與標(biāo)準(zhǔn)值比較,使用了葉綠素a(Fluka,純度95%)和葉綠素b(Fluka,純度95%)配制的丙酮溶液進(jìn)行測(cè)量,并將測(cè)得的吸收曲線與提取液的吸收曲線進(jìn)行了比較.實(shí)驗(yàn)采用葉綠素a為0.24mg(使用BP221D電子天平稱取)與純丙酮(>99.5%)試劑配制成50mL的4.8mg/L葉綠素a2丙酮溶液,以TU21800SPC型紫外2可見分光光度計(jì)探測(cè)紫外2可見光區(qū)的吸收曲線.然后使用葉綠素b的丙酮溶液(約4mg/L,在低于4的環(huán)境下保存)重復(fù)上述測(cè)量.探測(cè)結(jié)果如圖4所示.圖中葉綠素b的吸光度為實(shí)測(cè)的1/3.測(cè)得的葉綠素a和葉綠素b的吸收峰如表3所示.圖4葉綠素a和b2丙酮溶液

13、在可見光及近紫外區(qū)(300750nm)的吸收光譜© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第12期劉暢,等:利用光學(xué)多通道分析儀與分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素的紫外2可見光區(qū)吸收光譜表3葉綠素a和葉綠素b的吸收峰41吸收峰應(yīng)位于456nm處.而且葉綠素a2丙酮溶液的藍(lán)紫光區(qū)吸收峰也不位于420nm,而應(yīng)是431nm.至于紅光區(qū)的吸收峰,實(shí)測(cè)值與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相吻合.葉綠素a(4.8mg/L)/nm662431411382A葉綠素b(約4mg/L)/nm645456337A

14、0.3860.4660.3320.2160.9632.4030.6745結(jié)束語用分析化學(xué)中常用的吸光光度法對(duì)葉綠素提取液和葉綠素晶體進(jìn)行了初步的分析和研究,結(jié)果表明葉綠素在紅光和藍(lán)紫光區(qū)有一系列的吸收峰,因而能有效地吸收太陽輻射,使之轉(zhuǎn)化為綠色植物的生物能.進(jìn)一步研究的方向是通過分離葉.致謝:,!把精測(cè)的吸收曲線圖4與自行提取的葉綠素的吸收曲線圖2作對(duì)比,有以下值得注意的地方:a.在葉綠素提取液中的紅光吸收峰只有662nm,葉綠素b的645nm吸收峰不明顯.這可能是由于黃連翹葉片中葉綠素a和b的含量比約為73,葉綠素b的吸收峰被掩蓋在葉綠素a的662nm強(qiáng)峰之下.b.精測(cè)的2都大于紅光區(qū),.c

15、.提取液中藍(lán)紫光區(qū)的峰值位置與葉綠素a和b的吸收峰位置均不一致,這是因?yàn)樘烊坏闹参锶~子不可避免地含有多種植物色素,多種成分的植物色素的吸光性能疊加后,峰值點(diǎn)偏離了原來位置.把圖4與表1中峰值比較,由于TU21800SPC型紫外2可見分光光度計(jì)的測(cè)量誤差不應(yīng)達(dá)到20nm,筆者認(rèn)為文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)存在爭(zhēng)議.葉綠素b2丙酮溶液在435nm處不存在吸收峰,參考文獻(xiàn):1武漢大學(xué).分析化學(xué)M.北京:高等教育出版社,2000.2中山大學(xué)物理科學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院.基礎(chǔ)物理實(shí)驗(yàn)(創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)部分)Z.2004.3嚴(yán)國(guó)光,周佩珍,郭礎(chǔ),等.光合作用原初過程M.北京:科學(xué)出版社,1987.4羅慶堯,等.分光光度分析M.北京

16、:科學(xué)出版社,1992.5王英典,劉寧.植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.北京:高等教育出版社,2001.MeasurementofUV2VisabsorptionspectraofchlorophyllbyusingOMAandspectrophotometerLIUChang,WANGShi2cai,LUDong2yu(DepartmentofPhysics,SunYat2SenUniversity,Guangzhou510275,China)Abstract:Spectrophotometry,atypicalmethodinanalyticalchemistry,isusedinthispapertomeasureUV2Visabsorptionspectraofchlorophyllextractingliquidandcrystal.Andopticalmulti2channelanalyzerandspectrophotometerareusedalso.Theabsorptioncurveofchlorophyllisana2lyzed.Theexperimentcanconvenientlybeappliedtoexperimentteachingofphysics,chemistryandjun