丹參脂溶性及水溶性成分集成提取工藝研究

1、丹參脂溶性及水溶性成分集成提取工藝研究    【摘要】  目的 優(yōu)選丹參脂溶性及水溶性成分的集成提取工藝條件。方法 采用正交設(shè)計法,以丹酚酸B、丹參酮A為測定指標(biāo),采用高效液相色譜法測定其含量,并以此為指標(biāo)優(yōu)選集成提取工藝條件。結(jié)果 集成法可同時對丹參中脂溶性及水溶性成分進(jìn)行提取。優(yōu)選的提取工藝條件為：加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。結(jié)論 采用集成方法同時提取丹參水溶性及脂溶性部位,可省時、省工、節(jié)能,使丹參的提取工藝合理可行。 【關(guān)鍵詞】  丹參；提取工藝；正交試驗；丹酚酸B；丹參酮A   &

2、#160;Abstract：Objective To optimize an integration technique for extracting the liposoluble and water-soluble components of Salvia miltiorrhiza. Methods Salvianolic acid B and Tanshinone A were selected as marker components and determined by HPLC to optimize the integration extract process of Salvia

3、 miltiorrhiza by orthogonal test. Results The liposoluble and water-soluble active components of Salvia miltiorrhiza were efficiently extracted by the optimum integration technique. The integration technique for extracting was obtained：Salvia miltiorrhiza was added with 8 times alcohol of 70% and ex

4、tracted 1 hour for 2 times. Conclusion The liposoluble and water-soluble active components of Salvia miltiorrhiza can be extracted simultaneously by the novel extraction process which was reasonable and feasible. This new technique can be employed to reduce time, working and energy, and be suitable

5、for the morden production.    Key words：Salvia miltiorrhiza；integration technique for extracting；orthogonal test；Salvianolic acid B；Tanshinone A     丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖,主要含有二萜醌類脂溶性及酚酸類水溶性成分。2005年版中華人民共和國藥典(一部)以丹參酮A和丹酚酸B為指標(biāo)1,對丹參藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。為了能同時兼顧

6、丹參脂溶性及水溶性兩類有效成分,我們采用正交試驗法,以丹參酮A和丹酚酸B的含量為考察指標(biāo),對丹參的提取工藝進(jìn)行全面優(yōu)選,以使丹參的提取工藝更科學(xué)、合理。 1  儀器與試藥     Agilent 1100高效液相色譜儀。丹參酮A(批號110766- 200518)、丹酚酸B(批號111562-200605)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；丹參藥材購自安國藥材市場(經(jīng)河北省藥品檢驗所中藥室孫寶惠主任藥師鑒定為正品)。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。 2  方法與結(jié)果 2.1  丹參提取液

7、中丹參酮A的含量測定方法     采用Phenomenex Luna C18色譜柱(5 m,250 mm×4.6 mm,廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司),流動相：甲醇-水(7525),流速：1.0 mL/min,檢測波長：270 nm。精密稱取丹參酮A對照品10.21 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻；精密量取2 mL,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,作為對照品溶液(每1 mL中含丹參酮A 16.32 g)。分別取溶劑考察、粒度考察、正交試驗及驗證試驗中回流提取液的稀釋液,以0.45 m微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。分別

8、精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 L,注入液相色譜儀,測定回流液中丹參酮A的含量。 2.2  丹參提取液中丹酚酸B的含量測定方法     采用Phenomenex Luna C18色譜柱(5 m,250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-乙腈-甲酸-水(3010159)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm。精密稱取丹酚酸B 8.20 mg至10 mL棕色容量瓶中,加75%甲醇至刻度,搖勻,再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中,以75%甲醇定容至刻度,搖勻,得164.0 g/mL的丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分

9、別吸取溶劑考察、粒度考察、正交試驗及驗證試驗中回流提取液的稀釋液10 mL至25 mL的棕色容量瓶中,以相應(yīng)溶劑稀釋至刻度,搖勻,以0.45 m微孔濾膜濾過,作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 L,注入液相色譜儀,測定回流液中丹酚酸B的含量。 2.3  提取溶劑的選擇     丹參脂溶性成分易溶于高濃度乙醇,但在預(yù)試驗中,丹酚酸B在醇提時亦有相當(dāng)部分被提取出來,所以考慮采用脂溶性部位與水溶性部位進(jìn)行集成提取,以丹參酮A、丹酚酸B為含量測定指標(biāo),考察乙醇濃度對丹參脂溶性成分及水溶性成分提取率的影響。 

10、60;   稱取丹參藥材8份,每份30.0 g,平行2組,分別以8倍量水及10%、30%、50%、60%、70%、90%及95%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,藥液過濾,合并,放置室溫,定容至1 000 mL。將以上藥液取適量,按照上述含量測定方法測定丹參藥材及各提取方法樣品中丹參酮A及丹酚酸B的含量,并計算提取率。結(jié)果見表1。表1  丹參集成提取工藝溶劑的選擇（略）     表1顯示,90%乙醇提取時丹參酮A的提取率最高,為81.6%,但丹酚酸B提取率僅為48.3%；50%乙醇提取時,丹酚酸B提取率最高為75.1%,但丹

11、參酮A的提取率僅為40.1%；70%乙醇提取時丹參酮A的提取率為80.7%,丹酚酸B提取率為73.2%。為兼顧二者,我們初步選擇70%乙醇進(jìn)行提取。 為驗證高濃度乙醇提取后藥渣中丹酚酸B的含量,取70%、90%、95%乙醇提取后的藥渣再加8倍量的水回流提取2次,每次1 h,藥液過濾,合并,放置室溫,定容至1 000 mL。樣品液處理后以HPLC法進(jìn)行測定。結(jié)果表明：70%、90%及95%乙醇提取再水提的丹酚酸B的提取率分別為2.7%、18.4%及36.4%,均較低。由此可看出,醇提后再水提的工藝條件不合理,其原因可能是丹酚酸B長時間受熱,導(dǎo)致分解,使提取率降低,因此,確定采用70%乙醇進(jìn)行集成

12、提取的工藝條件可行。2.4  藥材粉碎粒度的考察     稱取丹參藥材飲片、最粗粉及粗粉各30.0 g,平行2組,分別以8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,藥液過濾,合并,放置室溫,定容至1 000 mL,搖勻,取適量以0.45 m微孔濾膜過濾,以HPLC法測定丹參酮A、丹酚酸B的提取率。結(jié)果見表2。表2  丹參醇提工藝藥材粉碎的粒度選擇（略）     表2顯示,飲片及粗粉提取時丹參酮A的提取率均較最粗粉高,但飲片及粗粉提取時丹參酮A的提取率在同一水平；飲片、最粗粉及粗粉提取時丹酚酸B

13、提取率分別為77.2%、80.5%、78.3%,三者在同一水平。從工業(yè)生產(chǎn)成本角度考慮,選擇飲片直接提取即可。 2.5  正交試驗  選擇乙醇用量、提取時間和提取次數(shù)3個因素,進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計；并以丹參酮A、丹酚酸B的提取率為指標(biāo),優(yōu)選丹參合提工藝條件。因素水平見表3。  平行稱取丹參藥材9份,每份30 g,按L9(34)正交表試驗條件,用70%乙醇進(jìn)行加熱回流提取、濾過,濾液合并至1 000 mL容量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,搖勻,測定。結(jié)果及分析見表4表6。表3  丹參集成提取因素水平表（略）表4  

14、;L9(34)丹參醇提工藝正交試驗結(jié)果（略）表5  丹參集成提取正交試驗丹參酮A方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00,*P0.05表6  丹參集成提取正交試驗丹酚酸B方差分析表(略)注：F 0.01(2,2)=99,F 0.05(2,2)=19,*P0.05,*P0.01    方差和直觀分析結(jié)果表明：因素C對丹參酮A及丹酚酸B的提取有顯著影響,取3水平；其次為A因素,取3水平；B因素影響最小,可取1水平；最佳提取條件應(yīng)為A3B1C3,但A和C因素的2水平與3水平相差不大,結(jié)合生產(chǎn),擬取2水平,故擬確定提取條件為A2B1C2,即

15、加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。 2.6  驗證試驗    按照正交試驗優(yōu)選醇提工藝條件進(jìn)行驗證試驗,結(jié)果見表7；結(jié)合工業(yè)生產(chǎn),選擇優(yōu)選工藝為丹參提取工藝,與正交試驗各工藝結(jié)果比較含量較高,表明丹參脂溶性成分及水溶性成分基本提取完全,該醇提工藝條件可行。表7  丹參醇提工藝驗證結(jié)果(略) 3  討論     以醇提法從丹參中提取的水溶性成分主要是丹酚酸B,以水提法則包含丹酚酸B、丹參素及原兒茶醛等水溶性成分。藥理研究表明,兩種提取方法所得部位的藥理作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義,且以醇提法所得的結(jié)果較好,并且隨丹酚酸B含量提高而活性提高。鑒于此,我們選擇丹酚酸B為水溶性成分的考察指標(biāo)。     丹參水溶性成分中,主成分丹酚酸B對熱不穩(wěn)定,這在