體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的實驗研究

1、    體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的實驗研究        摘要研究兔體外循環(huán)中肺的缺血再灌注損傷并探討其可能機(jī)制。采用兔體外循環(huán)模型，測定肺組織的丙二醛(MDA)，髓過氧化物酶(MPO)，一氧化氮(NO)含量、肺血管通透性(EB值)及肺組織濕干比(W/D值)。CPB組肺組織MDA含量(139.4±17.0)mmol/g明顯高于對照組(27.6±1.8)mmol/g,P0.01；MPO含量(9.4±0.6)u/g明顯高于對照組(1.9±0

2、.7)u/g，P0.01；NO含量(8.4±3.8)mol/g明顯低于對照組(20.9±1.7)mol/g，P0.01；W/D值(8.5±2.1)明顯高于對照組(4.5±0.9)P0.01；EB值(3.233±0.07)明顯高于對照組(1.394±0.06)，P0.01。動物實驗提示CPB中肺的缺血再灌注是肺損傷的重要原因，內(nèi)源性NO減少是肺損傷的重要環(huán)節(jié)。關(guān)鍵詞肺損傷體外循環(huán)一氧化氮 Experimental Study of the Ischemia-reperfusion Injury of Lung During CPBWan

3、g Huishan,Yi Dinghua,Wang Zengwei,et al.(Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital ofShenyang Command,Shenyang110015)(Department of Cardiothoracic Surgery,Xijing Hospital,FourthMilitary Medical University710032)AbstractAim:To study the ischemia reperfusion injury of lung during CPB and i

4、ts possible mechanism.Method:CPB models were set up with living rabbits.MDA,MPO,NO contents in lung tissue were determined.Ratio of wet lung tissue to dry one and the EB value were tested.The micro-and ultra-structure were observed.Results:MDA content of lung tissue in CPB(139.4±17.0 mmol/g) wa

5、s significantly higher than that in control group (27.6±1.8),P0.01;MPO content (9.4±0.6 u/g) was significantly higher than that of sham group (1.9±0.7 u/g),P0.01;No content (8.4±3.9 mol/g) was lower than that in sham group (20.9±1.7 mol/g),P0.01;Ratio of wet/dry (8.5±2.

6、1) was higher than that in sham group (4.5±0.9),P0.05;EB value (3.233±0.07) was higher than that in sham group (1.394±0.06).Conclusion:There is ischmic reperfusion injury during CPB and NO plays an important role in the injury.Key words：Lung injury; Cardiopulmonary bypass; Nitric oxid

7、e體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass,CPB)是心臟外科的一項重要技術(shù)。CPB中肺經(jīng)歷了缺血再灌注過程，引起炎性及內(nèi)皮損害，導(dǎo)致肺功能損害，嚴(yán)重者可引起死亡。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是內(nèi)皮釋放的一種小分子物質(zhì)，可使血管舒張，并在缺血再灌注損傷中有調(diào)節(jié)作用。本研究應(yīng)用兔CPB模型，探討肺缺血再灌注損傷后發(fā)生機(jī)制及NO的作用。材料和方法1.動物及分組健康家兔20只，體重2.0 kg2.5 kg，雌雄不拘，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為2組，每組10只：手術(shù)對照組，CPB組。2.CPB模型的建立實驗兔術(shù)前禁食水6 h，采用戊巴比妥鈉35 mg/kg，腹

8、腔注射。氣管切開插管，小動物呼吸機(jī)輔助呼吸(上海醫(yī)療儀器廠)。股動脈插管測壓，胸骨正中開胸，3 mg/kg肝素化后，分別于右頸總動脈，右心房和左心房插入動脈泵管，腔靜脈引流管和左房引流管，連接小型CPB機(jī)(Sarns-7000血泵，自制實驗用氧合器)。體外循環(huán)溫度為2832中度血液稀釋(HCT：0.200.24)，流量為70110 ml.kg-1.min-1，平均動脈壓維持在8 kPa12 kPa(6090 mmHg)?？傓D(zhuǎn)流時間為120 min，其中主、肺動脈阻斷60 min。停跳液采用冷晶體St.Thomas液。開放主動脈、肺動脈，心臟復(fù)跳，輔助循環(huán)60 min。留取組織標(biāo)本。手術(shù)對照組為

9、單純開胸，肝素化，120 min后，取標(biāo)本。3.檢測指標(biāo)與方法(1)病理切片取右下肺組織1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm,100 ml/L福爾馬林固定、石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察肺間質(zhì)水腫及白細(xì)胞浸潤程度。(2)電鏡取右下肺組織，置于戊二醛中固定，透射電鏡標(biāo)本常規(guī)制備。電鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞損傷情況。(3)組織丙二醛(MDA)含量100 g/L肺組織勻漿。應(yīng)用南京建成生物研究所提供的試劑盒，采用硫代巴比妥酸法，756型分光光度計在532 nm處比色。(4)組織髓過氧化物酶(MPO)活性的測定參照Suzuki等的方法，用消耗過氧化氫的量測定肺組織的

10、MPO活性。取100 g/L組織勻漿4，16 000 g離心15 min，棄去上清，再次勻漿，反復(fù)冰融2次，加入顯色劑TMB及H202的PBS中，37下，756型分光光度計655 nm處比色。(5)組織濕干重量比取肺組織稱重，烘干至恒重，計算濕干重量比。(6)血管通透性的測定每組取4只動物，在CPB結(jié)束前，由肺動脈灌注1%伊文氏藍(lán)(Evan's Blue,EB)，20 mg/kg，灌注后靜置10 min，取出肺臟用生理鹽水以2.94 kPa(22 mmHg)壓力灌注肺動脈。取小塊肺組織稱重，加入甲酰胺3 mol/100 mg，置于50隔水式培養(yǎng)箱中24 h，提取肺組織滲出的伊文氏藍(lán)，稱

11、干重。將肺組織伊文氏藍(lán)提取液3 ml倒入測試杯。756型分光光度計在620 nm處比色以EB強(qiáng)度值計算。(7)一氧化氮的測定100 g/L肺組織勻漿，測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。應(yīng)用硝酸還原酶特異性地將NO3-還原為NO2-，756分光光度計在550 nm處比色。4.統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均以±S表示。各組以團(tuán)體t檢驗，P0.05為差異顯著界限。結(jié)果1.組織顯微結(jié)構(gòu)觀察光鏡下見CPB組肺組織間質(zhì)水腫，內(nèi)有較多的白細(xì)胞浸潤。而對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯壁增厚。2.組織超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡下見CPB組型細(xì)胞胞漿空泡化，板層體消失，毛細(xì)血管破損，線粒體消失。而對照組型細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量板層

12、體結(jié)構(gòu)存在，完整清晰胞核完整。3.MDA含量的變化CPB組MDA含量明顯高于對照組(P0.01)，見表1。4.MPO含量的變化CPB組MPO含量明顯高于對照組(P0.01)，見表1。5.組織濕干比(W/D)的變化CPB組的W/D值明顯高于對照組(P0.05)，見表1。6.血管通透性的變化與對照組的EB值相比，CPB組明顯增高(P0.01)，見表1。7.NO含量的變化CPB組明顯低于對照組(P0.01)，見表1。表1各組肺組織MDA、MPO、PLA2、W/D及NO的變化(X±S)MDA(mmol/g)MPO(U/g)EBW/DNO(mol/g)對照組27.6±1.81.9&#

13、177;0.71.394±0.064.5±0.920.9±1.7CPB組139.4±17.09.4±0.63.233±0.78.5±2.18.4±3.8討論體外循環(huán)(CBP)后肺部并發(fā)癥是心血管外科手術(shù)后常見的并發(fā)癥。CPB時，肺動脈血流完全停止，肺不通氣，僅靠支氣管動脈的少量灌注，此時肺處于缺血缺氧狀態(tài)。當(dāng)循環(huán)開放后，肺血流恢復(fù)，肺經(jīng)歷了缺血再灌注的過程 。本研究結(jié)果顯示，體外循環(huán)后肺白細(xì)胞浸潤加重；氧自由基產(chǎn)物(MDA)含量亦上升，W/D值增大，MPO，EB值升高。肺組織經(jīng)受氧自由基損傷，血管通透性增加，出現(xiàn)肺

14、水腫。體外循環(huán)相關(guān)的急性肺損傷的原因是多方面的。肺的缺血再灌注是重要原因之一。許多血管活性物質(zhì)，如白三烯B4和血小板激活因子的產(chǎn)生，使血管收縮，通透性增加，促使白細(xì)胞對血管壁的粘附。同時大量白細(xì)胞被激活，使得被“扣押”在肺血管中的中性粒細(xì)胞與大量的炎癥介質(zhì)浸潤至肺組織間質(zhì)中，引起氧自由基產(chǎn)生，破壞脂質(zhì)細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和酶。因此，可以認(rèn)為肺缺血再灌注損傷中，中性粒細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用，它貫穿了肺損傷的全過程。近年來，對于血管內(nèi)皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞的激活及氧自由基的產(chǎn)生可引起血管內(nèi)皮功能的損害。這可能是介導(dǎo)肺損傷的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞受損后，釋放大量的活性因子，其表面的粘附分子表達(dá)增強(qiáng)，增加了

15、與白細(xì)胞的粘附。同時，血管通透性改變，引起中性粒細(xì)胞滲入肺組織，發(fā)生肺間質(zhì)水腫，甚至肺水腫。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是新近發(fā)現(xiàn)的一種重要的調(diào)節(jié)生命活動的小分子物質(zhì)。由左精氨酸通過NO合酶(Nitric oxide synthase,NOS)催化生成。NO在急性炎癥期具有很強(qiáng)的抑制炎癥和調(diào)節(jié)功能，通過改變細(xì)胞內(nèi)GMP水平降低血管通透性，亦可中和氧自由基。本研究發(fā)現(xiàn)，CPB后NO水平明顯下降，與Morita等的結(jié)論相一致，這表明CPB肺損傷中，NO的調(diào)節(jié)能力下降?？傊?，CPB使肺經(jīng)歷了缺血再灌注過程，內(nèi)皮細(xì)胞受損傷，內(nèi)源性NO減少。內(nèi)皮功能失調(diào)，導(dǎo)致其抑制中性粒細(xì)胞粘附的能力下降

16、，血管內(nèi)皮通透性增多，大量中性粒細(xì)胞浸潤至肺組織，引起氧自由基損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜穩(wěn)定性破壞，引起肺損傷及肺水腫。王輝山(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科110015)汪曾煒(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科110015)易定華(西安第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心胸外科710032)徐鵬(西安第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心胸外科710032)參考文獻(xiàn)1，Suzuki K,Ota H,Sasagawa S,et al.Assay method for myeloperoxidase in human polymorphonuclear leukocytes.Anal Biochem,1983,132(4):345352.2，Oilver JA.Endothelium-derived relaxing factor contributes to the regulation of endothelial permeability.J Cell Physiol,1992,151(3):506511.3，Rubanyi GM,Elena H,Cantor EH et al.Cytoprotective function of nitric oxide:Inactivation of superoxide radicals produced by