Ezrin蛋白在糖尿病腎病鼠腎小球的表達及活性維生素D對其的影響

1、Ezrin蛋白在糖尿病腎病鼠腎小球的表達及活性維生素D對其的影響                 作者：楊媛媛，鄒敏書 余健 聶國明 羅莉漫 徐洪濤 趙林雙 何威遜【摘要】  目的：觀察Ezrin蛋白在糖尿病腎病(DN)大鼠腎小球的表達以及活性維生素D 1,25(OH)2D3對其表達的影響。方法:Wistar大鼠隨機分為對照組和糖尿病腎病模型組;后者經(jīng)腹腔注射鏈佐脲菌素(STZ)誘導(dǎo)DN大鼠模型，再隨機分DN組和1,

2、25(OH)2D3組。1,25(OH)2D3組皮下埋置滲透性微量泵，給予1,25(OH)2D3 0.03 ng/g·d-1，連用8周。檢測大鼠血糖(Glu)、腎重/體重(KW/BW)、24 h尿蛋白(24 h UP)、血肌酐(Scr)、尿足細胞(UPC)。采用間接免疫熒光檢測腎小球Ezrin蛋白的表達與分布。WT1免疫組化染色檢測每個腎小球足細胞數(shù)目。結(jié)果：與對照組相比，DN組Glu、KW/BW、24 h UP、Scr、UPC顯著升高;腎小球Ezrin表達顯著下降，足細胞數(shù)目減少。DN組與1,25(OH)2D3組Glu水平無顯著性差異，1,25(OH)2D3組KW/BW、24 h U

3、P、Scr、UPC較DN組顯著降低;而腎小球Ezrin表達及足細胞數(shù)目顯著增加。對照組Ezrin蛋白熒光染色沿腎小球毛細血管壁均勻線型分布;DN組呈不連續(xù)的粗顆粒樣分布;1,25(OH)2D3組部分呈短線型熒光。Ezrin表達熒光強度與腎小球足細胞數(shù)目呈正相關(guān)(rs=0.51，P<0.01)，與24 h UP、UPC呈負相關(guān)(rs=0.43，0.45，P<0.01)。結(jié)論：1,25(OH)2D3可減少DN鼠腎小球Ezrin的表達，減少足細胞脫落，維持腎小球足細胞數(shù)量。 【關(guān)鍵詞】  足細胞;活性維生素D;Ezrin;糖尿病腎病;大鼠ABSTRACT Objective:

4、To observe the effect of 1,25Dihydroxyvitamin D3(1,25(OH)2D3) on the expression of Ezrin in glomeruli of rats with diabetic nephropathy(DN). Methods: Wistar rats were randomly divided into two groups: control group and DN model group which was induced by peritoneal injection of streptozotocin(STZ).

5、After these models were successfully established, they were randomly divided into two groups: DN group and 1,25(OH)2D3 group. 1,25(OH)2D3 group was embedded with the osmotic minipump for giving 0.03 ng/g-1·d-1 1,25(OH)2D3 for 8 weeks. Blood glucose(Glu), the ratio of kidney weight/body weight(K

6、W/BW), 24hour urinary protein(24 hUP), serum creatinine(Scr) and urinary podoctye(UPC) were measured. The expression and distribution of Ezrin in glomeruli was detected by indirect immunofluorescence. Podocyte number per glomeruli was determined by WT1 immunohistochemistry. Results: Compared with co

7、ntrol group, the level of Glu, KW/BW, 24 hUP, Scr, UPC in DN group were significantly increased. The expression of Ezrin in glomeruli statistically decreased. Average numbers of podocytes per glomeruli was dramatically reduced. There was no significant difference of Glu between DN and 1,25(OH)2D3 gr

8、oup. KW/BW, 24 hUP, Scr, UPC were significantly lower in 1,25(OH)2D3 group than in DN group. The expression of Ezrin and the numbers of podocytes per glomeruli in 1,25(OH)2D3 group were higher than those in DN group. In control group, fluorescent staining of Ezrin was detected as a fine, linearlike

9、pattern along the glomerular capillary loop; Ezrin staining changed to a discontinuous, coarse granular pattern in DN rats, short linear pattern was observed in part of the glomeruli in 1,25(OH)2D3 group. Fluorescence intensity of Ezrin showed a positive correlation with the numbers of podocytes per

10、 glomeruli (rs =0.51, P<0.01),and a negative correlation with 24 hUP,UPC(rs =0.43,0.45, P<0.01). Conclusions: 1, 25(OH)2D3 could contribute to increasing Ezrin expression in DN rats, reduce podocyte detachment to preserve podocyte number.KEY WORDS Podocyte; 1, 25(OH)2D3; Ezrin; Diabetic nephro

11、pathy; Rat腎小球臟層上皮細胞足細胞(podocyte, PC)是位于腎小球基底膜(GBM)外側(cè)的終末分化細胞，構(gòu)成腎小球濾過膜上機械屏障和電荷屏障的重要組成部分，其緊貼于腎小球基底膜(GBM)外側(cè)。因此，PC損傷、脫落是蛋白尿發(fā)生的病理基礎(chǔ)之一。近年來，PC內(nèi)部結(jié)構(gòu)的特殊蛋白成為研究的熱點。podocalyxin(PCX)、鈉氫交換調(diào)節(jié)因子2(NHERF2)、Ezrin分布于PC足突頂部，三者構(gòu)成PCX/NHERF2/Ezrin復(fù)合體參與了PC生理和病理的發(fā)生機制，其中PCX是維持負電荷屏障和保持足細胞形態(tài)的重要分子，它通過NHERF2/Erzin與肌動蛋白骨架actinin4連接，

12、維持PC結(jié)構(gòu)穩(wěn)定1。Ezrin參與PC形態(tài)的維持、運動、黏附，并與PC生存有關(guān)?；钚跃S生素D1,25(OH)2D3是臨床上常用的藥物，其可減少PC脫落，多途徑保護腎臟2。而其對Ezrin蛋白表達的影響作用不明。本文在DN模型鼠上觀察1,25(OH)2D3對Ezrin表達及PC排泄的影響，探討對其腎保護作用的機制。1 材料與方法1.1 糖尿病腎病大鼠的建立及分組健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200250 g，由廣州軍區(qū)武漢總實驗動物中心提供。動物室溫度25 ，濕度70%，12 h交替照明，大鼠自由飲水、進食。一次性腹腔注射鏈脲菌素(STZ)65 mg/kg(美國sigma公司生產(chǎn)，用0.1 m

13、ol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖液配成2%的溶液)以誘導(dǎo)DN大鼠模型，3 d后測血糖，血糖16.7 mmol/L確認為DM大鼠模型制備成功，繼續(xù)喂養(yǎng)，3周后用雙縮脲法測定尿蛋白定量30 mg/24 h時，確認DN模型制備成功，將20只誘導(dǎo)成功的DN大鼠隨機分兩組：(1)DN組(n=10);(2) 1,25(OH)2D3組(n=10)，埋植滲透性微量泵按0.03 ng/g·d-1皮下給予1,25(OH)2D33，連用8周。對照組(n=10)及DN組皮下給予等體積的蒸餾水。給予1,25(OH)2D3 8周抽血查餐后2 h血糖(Glu)、血清肌酐(Scr)，代謝籠收集24 h尿液，檢測2

14、4 h尿蛋白(24 h UP)及尿液足細胞(UPC);然后處死大鼠，取出雙腎，雙腎與體重之比，后腎小球免疫組化及免疫熒光染色。1.2 24 h UP、UPC檢測24 h UP用考馬斯亮藍比色法測定。UPC檢測按鄒敏書等報道4的方法進行，以間接免疫熒光方法檢測腎小球足細胞特異性核心蛋白WT1，沉渣涂片WT1陽性的細胞即為PC。方法如下：收集大鼠24 h尿液，沉渣離心甩片，離心5 min，抽出上清后，尿沉渣用0.01 mol/L PBS洗滌沉淀，溶于10 mL PBS，離心5 min，將尿沉渣置于經(jīng)過多聚賴氨酸包被處理的玻片上，玻片空氣干燥30 min ，4 °C 丙酮固定5 min，滴

15、加小鼠抗WT1抗體在室溫條件下與足細胞特異性標志W(wǎng)T1結(jié)合1 h，PBS洗滌，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗小鼠抗體IgG進行染色，在37 溫育30 min，洗滌，洗凈后，在熒光顯微鏡下觀察尿沉渣涂片中WT1染色陽性細胞即為PC。隨機選擇20個高倍視野觀察尿沉渣涂片中的WT1陽性細胞，結(jié)果用每個視野平均WT1陽性細胞數(shù)表示。小鼠抗WT1單克隆抗體購自美國NeoMarkers公司，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠二抗購自中山公司。1.3 免疫組化檢測腎小球足細胞數(shù)量3 m厚的腎組織切片常規(guī)處理，PAS染色，在普通光學顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。腎組織WT1免疫組化染色定量測定腎小球PC數(shù)目，W

16、T1陽性細胞即為足細胞5，操作按說明。以PBS替代一抗。每只鼠隨機選擇20個腎小球在高倍鏡下(×400)計數(shù)PC數(shù)目，取平均值表示每個腎小球PC數(shù)量。1.4 間接免疫熒光檢測腎小球Ezrin蛋白的表達腎組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，切取3 m石蠟切片，微波抗原修復(fù)，小鼠抗Ezrin單克隆抗體(150稀釋，福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)，4 孵育過夜，PBS洗滌，F(xiàn)ITC標記的羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育40 min，PBS洗滌，封片，以PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果采用熒光顯微鏡(上海宙山精密光學儀器有限化司)觀察。利用LaserPix4.0分析軟件，在每一例切片上隨機分別測量10個腎小球面積和每

17、個腎小球內(nèi)Ezrin陽性區(qū)域所占的面積，計算出每個腎小球內(nèi)Ezrin陽性區(qū)域所占腎小球面積的比值，取其平均值。1.5 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)用(±s)表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件完成，先進行方差齊性檢驗，方差齊時，多組比較用oneway ANOA LSD方差分析;方差不齊，多組比較KruskalWallis H秩和檢驗，有顯著性差異時，兩組比較用MannWhitney Utest。相關(guān)分析用Spearman等級相關(guān)分析法，P<0.05 具有統(tǒng)計學意義。1         2 結(jié)果3組大鼠Glu、K

18、W/BW、24 h UP、 Scr、 UPC檢測結(jié)果比較見表1。3組大鼠腎小球Ezrin的熒光表達強度及每個腎小球足細胞數(shù)目見表2。表1 3組大鼠Glu、KW/BW、 24 h UP、 Scr、 UPC比較注：與對照組相比，P<0.01;與DN組相比，#P<0.01，#P<0.05。表2 腎小球內(nèi)Ezrin表達熒光強度及每個腎小球足細胞數(shù)目的比較注：與對照組相比，P<0.01;與DN組相比，#P<0.01。3組大鼠腎球Ezrin的熒光分布及WT1免疫組化 Ezrin表達呈現(xiàn)綠色熒光: 對照組沿腎小球基底膜呈線型方式表達;DN組呈粗顆粒樣不連續(xù)分布，節(jié)段性缺失明顯;

19、1,25(OH)2D3組線型表達稍模糊，表達缺失較輕。腎小球WT1免疫組化示W(wǎng)T1陽性細胞即PC呈現(xiàn)深藍色，靠近腎小球基底膜分布：對照組PC染色分布均勻，數(shù)目多;DN組PC明顯減少;1,25(OH)2D3組PC數(shù)目較對照組稍減少，較DN組明顯較多。Ezrin表達與其他指標的相關(guān)性分析：Ezrin表達熒光強度與腎小球PC數(shù)目呈正相關(guān)，rs為0.51，P<0.01;與24 h UP、UPC呈負相關(guān)，rs分別為為-0.43，-0.45，P<0.01;與Glu、KW/BW、Scr無相關(guān)性，rs分別0.12、0.22、0.25，P>0.05。3 討論Ezrin蛋白是一種將細胞骨架與細胞

20、膜連接起來的特定蛋白，是ERM蛋白(Ezrin，Radixin，Moesin)家族的一員，為細胞內(nèi)蛋白，通過氨基端與細胞膜相連，羧基端與肌動蛋白細胞骨架相連，成為膜細胞骨架的連接子。Exrin作為PC的標志蛋白之一，其一端與PC頂膜區(qū)表面覆蓋一層負電荷的涎粘蛋白PCX及NHERF2相連，另一端與肌動蛋白相連，對維持負電荷和保持PC形態(tài)起重要作用。OstalskaNowicka等6報道，從微小病變(MCD)、彌散性腎小球系膜增生(DMP)到局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)病例中，免疫組化顯示PCEzrin的表達進行性減少;Ezrin是PC損傷的有效標志，在激素抵抗和以蛋白尿為主要表現(xiàn)的腎小球疾病

21、中，Ezrin表達減少導(dǎo)致濾過屏障通透性增加。Lai等7報道，IgA患者腎小球Exrin免疫染色顯著減弱，Exrin mRNA 表達與蛋白尿與肌酐清除率相關(guān);單用抗TNF或TGF抗體可部分恢復(fù)Exrin的表達，2種抗體聯(lián)用可完全恢復(fù)Exrin的表達。本文結(jié)果表明，Ezrin表達與腎小球PC數(shù)目呈正相關(guān)，與尿蛋白及尿PC排泄呈負相關(guān)。表明Ezrin正常表達對防止PC脫落，維持腎小球PC數(shù)目，減輕蛋白尿起重要作用。PC損傷脫落，腎小球PC數(shù)量減少，不僅可引起蛋白尿，且有報道，尿液中脫落PC數(shù)量較尿蛋白更加敏感地反映進展性腎小球損傷8。1,25(OH)2D3是臨床中常用的藥物，對腎臟的保護作用初現(xiàn)端

22、倪:減少PC丟失及肥大;通過抑制腎素生成，下調(diào)腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)系統(tǒng);降低慢性腎疾病(CHD)蛋白尿;降低纖維細胞因子TGF的生成9。但對PC保護作用機制尚不明確。Kuhlmann3報道1,25(OH)2D3可減少腎大部分切除鼠PC肥大及丟失，進而減輕蛋白尿及腎小球硬化。Schwarz等10發(fā)現(xiàn)給大部分腎切除大鼠服用1,25(OH)2D3后，腎小球硬化指數(shù)和尿白蛋白排泄均減少，TGF1表達顯著減少，腎小球損傷進展得到減緩。本文結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3能減輕DN鼠尿蛋白、尿PC的排泄，降低血肌酐，維持腎小球PC的數(shù)目;同時可增加腎小球Ezrin的表達，減少其分布異常。因此，1,

23、25(OH)2D3的PC保護作用部分可能增加Ezrin的表達，減少其異位分布，維持了PC的數(shù)目及結(jié)構(gòu)，從而減少了尿蛋白的濾出。其對PC的作用不依賴于對鈣磷代謝的影響?？傊?，1,25(OH)2D3能上調(diào)腎小球Ezrin的表達，減少PC脫落，維持腎小球PC的數(shù)目，其PC保護作用可能與增加Ezrin的表達，減少其分布異位有關(guān)?！尽?#160; 1 Mundel P, Shankland SJ. Podocyte biology and response to injuryJ. J Am Soc Nephrol, 2002, 13(12): 30053015.2 鄒敏書,余 健,何威遜.1,25二羥維

24、生素D在慢性腎疾病中的作用J.國際兒雜志，2008，35(4):346348.3Kuhlmann A, Haas CS, Gross ML, et al. 1,25Dihydroxyvitamin D3 decreases podocyte loss and podocyte hypertrophy in the subtotally nephrectomized ratJ. Am J Physiol Renal Physiol, 2004, 286:F526F533.4 鄒敏書,何威遜,余 健,等.1,25(OH)2D3對局灶節(jié)段性腎小球硬化大鼠尿PC排泄及腎小球WT1分布的影響J.臨床兒科

25、雜志,2008,26(4):291294.5 Sanden SK, Wiggins JE, Goyal M, et al. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor1 protein used as a podocyte nuclear markerJ. J Am Soc Nephrol,2003, 14(10):248424