實(shí)時(shí)FQ－PCR與時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測乙型肝炎病毒分析

1、實(shí)時(shí)FQPCR與時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測乙型肝炎病毒分析        摘  要  目的：探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)定量檢測乙型肝炎病毒(HBV-DNA)與時(shí)間分辨熒光免疫分析法對乙型肝炎免疫標(biāo)志物(HBV-M)檢測對乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷的敏感性。方法：采用兩種方法分別對800例本院傳染科住院及門診可疑病人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果：用FQ-PCR 檢測800例，HBV-DNA陽性例數(shù)602，陽性率 87.81%，用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測800例，HBV-M的陽性例數(shù)477，陽

2、性率59.63%，通過檢檢，=2.98，P<0.05。結(jié)論：在乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷中，F(xiàn)Q-PCR檢測乙型肝炎病毒HBV-DNA更優(yōu)于時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測乙型肝炎免疫標(biāo)志物HBV-M。 關(guān)鍵詞  乙型肝炎；聚合酶鏈反應(yīng)；時(shí)間分辨熒光免疫分析乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是嚴(yán)重危害人類健康的病毒之一，HBV感染后參考血清免疫學(xué)標(biāo)志物如HBsAg、HBsAb、HBeAg、 HBeAb、HBcAb(即乙肝兩對半；HBV-M)等，它們的敏感性及特異性可滿足一般臨床應(yīng)用。但近幾年研究發(fā)現(xiàn)由于一些HBV變異株的出現(xiàn)導(dǎo)致臨床部分患者的HBV感染復(fù)制狀況難以判

3、斷，甚至漏檢。定量PCR檢測HBV-DNA可對乙肝患者體內(nèi)HBV復(fù)制有更直接的了解，亦有利于臨床對HBV感染的診斷、治療方案的選擇及療效判定。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR(FQ-PCR)和時(shí)間分辨兩種方法同時(shí)檢測了800份肝炎患者血清，并對結(jié)果進(jìn)行了對比觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。1  材料和方法1.1  材料為2005年10月2005年12月本院傳染科住院及門診病人800例。實(shí)時(shí)FQPCR試劑盒購自中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。DNA擴(kuò)增儀為美國產(chǎn)ABI7000。 時(shí)間分辨熒光免疫分析法試劑盒購自上海新波技術(shù)有限公司，HBVM儀器為上海新波生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的時(shí)間分辨熒光免疫分析

4、。1.2  方法無菌抽取受檢者靜脈血2mL，8,000rpm離心5min，吸取上清（注意勿帶入紅細(xì)胞）。標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20待測。取血清標(biāo)本50L，加等量DNA提取液打勻，恒溫金屬浴10min(誤差不超過1min)。10,000rpm離心5min，取上清液5L做PCR反應(yīng)。設(shè)置PCR程序?yàn)?32min預(yù)變性，然后按9345s5560s ，先做10個(gè)循環(huán)，最后按9330s5545s，做30個(gè)循環(huán)，所有檢測均由同批檢測人員進(jìn)行操作及分析。2  結(jié)果      HBV-DNA定量測量結(jié)果：800例肝炎患者血清標(biāo)本中

5、，350例HBV-DNA陽性，450例陰性，陽性最低滴度為2.74×103copies/m，最高滴度為8.73×108copies/m。其中乙肝大三陽組HBV-DNA檢出率為95.83；乙肝小三陽組HBV-DNA 檢出率為43.48；HBsAg、HBcAb(+)組HBV-DNA檢出率高達(dá)40.00；所有HBsAb(+)組均未檢出HBV-DNA；HBV-M全陰組HBV-DNA 檢出率為2.17。見表1表3。表1  用FQ-PCR檢測病人HBV-DNA的結(jié)果HBV-DNA定量測定值范圍（略）注：試劑盒的檢測下限<103為陰性。表2  用時(shí)間分辨熒光免疫

6、分析法檢測病人HBV-M的結(jié)果（略）表3  兩種方法對乙型肝炎患者血清標(biāo)本檢驗(yàn)結(jié)果比較（略）3  討論      通過上述兩種方法對800例臨床血清標(biāo)本的檢測，F(xiàn)Q-PCR檢測HBV-DNA的陽性檢出率87.81%,用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測HBV-M的陽性檢出率59.63%,兩種方法的2檢驗(yàn),P<0.05,說明兩種方法對乙型肝炎病毒的檢測有明顯的差異。              

7、;  在216例乙肝大三陽患者血清中檢出HBV-DNA陽性207例，檢出率達(dá)95.83，定量結(jié)果在1.82×106copies/m8.73×108copies/m之間，說明“大三陽”與HBV-DNA是有顯著相關(guān)的。但是，不同個(gè)體病毒復(fù)制程度差異較大，其中有9例HBeAg陽性但HBV-DNA定量檢測結(jié)果陰性，這9例服用拉米夫啶進(jìn)行抗病毒治療者，使HBeAg陰轉(zhuǎn)明顯滯后，所以“大三陽”與HBV-DNA并不能劃上等號，在抗病毒治療過程中，兩者均獲得轉(zhuǎn)陰，可認(rèn)為抗病毒治療療效顯著；如果其中一項(xiàng)陰轉(zhuǎn)，則說明有效，但仍需繼續(xù)抗病毒治療，直到兩項(xiàng)病毒指標(biāo)都轉(zhuǎn)陰為止。故

8、雖然HBeAg(+)與HBV-DNA具有良好一致性，但檢查HBV-DNA則是更為直接、及時(shí)的判斷抗病毒療效的依據(jù)。161例乙肝小三陽患者血清中的70例檢出HBV-DNA，檢出率達(dá)43.48，定量結(jié)果均值亦達(dá)511×108copies/mL，說明抗HBe的存在并不表示患者體內(nèi)沒有病毒復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒容易“突變”(即它的基因發(fā)生變異)，造成病毒e抗原停止表達(dá)，轉(zhuǎn)換成“小三陽”，實(shí)際上該類患者體內(nèi)的HBV-DNA仍然存在活躍的復(fù)制，其傳染性仍很強(qiáng)，且變異后的病毒更不易清除，也更容易進(jìn)展到肝硬化，這種情況可能要比“大三陽”危害更大，所以更應(yīng)做HBV-DNA定量分析，以確定是否需要治療和觀察抗病毒療效。      總之，我們的結(jié)論是