導(dǎo)向溶栓研究的某些進展

1、導(dǎo)向溶栓研究的某些進展            早期溶栓治療，可以縮小心肌梗塞面積、維護左室功能、降低死亡率，因而成為急性心肌梗塞的標準療法之一。然而當前應(yīng)用的溶栓劑仍存在明顯的缺陷，主要是特異性差，要達到完全溶解血栓的目的，常需較大劑量連續(xù)靜脈給藥，因而增加了全身纖維系統(tǒng)激活致出血的危險性。如何將栓劑特異性靶向到血栓部位，一者提高溶栓效力，二者降低全身出血等副反應(yīng)，一直是該領(lǐng)域研究的熱點，近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為解決溶栓導(dǎo)向性問題提供了很多有效途徑，茲就這方面的研

2、究進展作一簡要綜述。 1靶向溶栓劑的構(gòu)建 近年來，運用分子生物學(xué)理論和基因工程技術(shù)，對現(xiàn)有的溶栓劑分子進行重組和修飾，通過增加纖維蛋白結(jié)合位點或?qū)⑷芩▌┡c特異性抗體連接，構(gòu)建了很多新型的，特異的靶向溶栓劑。 1.1 t-PA/u-PA雜合體： t-PA和u-PA是兩種主要的生理性纖溶酶原活化劑，均可通過裂解Arg-Val鍵而將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，但二者又有其各自的特點。 t-PA具有對纖維蛋白特異性親和作用，這是由于t-PA分子的環(huán)餅結(jié)構(gòu)域（Kringlez）帶有一個賴氨酸結(jié)合位點（LBS），可介導(dǎo)與纖維蛋白結(jié)合；u-PA對纖維蛋白沒有特異性，但對纖溶酶原具有很強的專一催化作用。為了充分利用

3、二者的長處，Agnelli等1構(gòu)建了由來片t-PA a鏈及u-PA的絲氨酸蛋白酶部分組成的雜合體，動物體內(nèi)實驗表明，其溶栓效力提高了3-16倍，循環(huán)半衰期延長6-20倍。但也有些類似的雜合體并顯示出纖維蛋白特異性親和性。Novokhatry等2通過差異掃描測熱法（differential scanning calorimetry）研究了這種雜合蛋白分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，結(jié)果顯示t-PA的LBS與來自u-PA的leu144-lys157的殘基結(jié)合，從而封閉了LBS，使其與纖維蛋白的親和性減弱。 1.2特異性抗體靶向溶栓劑：利用單克降抗體與其相應(yīng)抗原的高度特異性親和作用來實現(xiàn)溶栓劑的靶向作用

4、。一種方法是將抗體通過化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)至溶栓劑分子上，但由于來源于動物的單克隆抗體的異體成分會引起人體的免疫反應(yīng)，故近來多應(yīng)用基因工程技術(shù)將編碼抗體結(jié)合位點和纖溶酶原激活劑催化位點的兩種基因雜交后表達出融合蛋白，這樣可以以人的免疫球蛋白代替大部分抗體的異體結(jié)構(gòu)，減少免疫反應(yīng)3。Holvoet等4應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了兩個重組的雜合分子：K12G0S32和K12G2S32，前者是由scu-PA的低分子量衍生物（Ala132Leu441）與纖維蛋白片段D-二聚體特異性單克隆抗體的可變區(qū)片段Fv組成的雜合分子；后者是用Glu取體Asn88，從而使Fv脫糖基化。體內(nèi)外溶栓實驗表明：K12G0S32的溶栓

5、效力較rscu-PA提高了10倍，而K12G2S32提高了2倍，但K12G2S32的血漿半衰期較rscu-PA延長了4倍。提示這種雜合的抗體靶向性PA不僅可增加特異性溶栓效力，而且可減少清除率。 此外，大量研究證明，血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）的單克隆抗體靜脈注射后能積聚在多種動物的肺部。Muzykanktor等5根據(jù)一特性，使用Streptavidin作用交聯(lián)劑，將scu-PA、t-PA及SK分別與抗ACE單克隆抗體交聯(lián)，動物體內(nèi)實驗表明，這些交聯(lián)物對肺血管有特異靶向性，并且延長了在肺血管床滯留的時間，為肺栓塞的纖溶治療提供了一個研究基礎(chǔ)。 1.3 t-PA/P-selectin融合蛋白：P-

6、selectin是血管粘附蛋白選擇素家族中的成員之一，是一種分子量為140kD的糖蛋白。P-selectin主要存在于血小板的a顆粒及內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體中，內(nèi)皮細胞及血小板受環(huán)境刺激活化時，P-selectin迅速轉(zhuǎn)移到細胞表面，在血栓形成初期的白細胞貼壁流動中起著非常重要的作用。P-selectin的配基主要存在于白細胞，單核細胞及某些淋巴細胞表面。Fujise等應(yīng)用基因工程技術(shù)表達出含t-PA及P-selectin的融合蛋白，體內(nèi)溶栓實驗表明，該雜合分子具備與t-PA一樣的溶栓活性，而且保存了P-selectin配基結(jié)合的能力，提示這種雜合蛋白可能提供一種靶向t-PA

7、到血栓區(qū)域的有效方法。 1.4 rscu-PA/AV雜合體：Annexin(AV)是從人胎盤中純化 的一種抗凝蛋白，在Ca2+的存在下，其對裸露在活化血小板膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度的親和性，因而AV可作為一種靶向劑，將溶栓劑靶向到富含血小板的血栓。無論是應(yīng)用化學(xué)方法構(gòu)建的AV與UD交聯(lián)物7，還是應(yīng)用基因重組技術(shù)獲得的rscu-PA/AV雜合體8均獲得了交叉分子的酶活性及膜結(jié)合活性，從而增加了對血栓的特異性，提高了溶栓效力。 1.5 t-PA或u-PA突變體：Yamada等通過在 t-PA分子中引入Arg-Gly-Asp(RGD)序列構(gòu)建了幾種突變體 t-PA。實驗表明，這種突變體具有

8、以RGK依賴的方式對血小板整合素（如22）高度親和的特性。同時仍保留了t-PA一樣的纖溶活性，提示這種雙功能分子可用作血小板血栓的特異性溶栓劑。董晨等10將人工合成的編碼GPRP四肽的寡核苷酸序列連接至scu-PA(144-411)克隆脫氨核糖核酸（cDNA）的5端，并將其重組克隆到表達載體PKK233-2中，在大腸桿菌中得到5%的表達量。體外實驗表明，這種突變體纖溶效率為LUK的2-3倍，對纖維蛋白的親和性比LUK提高了6倍，且對纖維蛋白原親和力很強，提示GPRP四肽可提高尿激酶對纖維蛋白的專一性。 構(gòu)建具有趨血栓特異性的靶向溶栓劑是實驗導(dǎo)向溶栓的一個主要途徑，然而盡管應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了

9、很多這類新型靶向溶栓劑，但其溶栓效力及血栓特異性作用仍達不到理想的程度，因而仍處在實驗研究階段，未能應(yīng)用于臨床。 2 脂質(zhì)體靶向攜載溶栓劑 脂質(zhì)體是一種由磷脂雙分子層組成的囊泡，由于其免疫原性低，體內(nèi)易代謝，無毒副作用，因而可作為一種理想的藥物載體。晚近，很多研究表明11，12，應(yīng)用脂質(zhì)體包裹t-PA或鏈激酶（SK），可大大降低出血等并發(fā)癥，同時促進了SK被遞送到血栓及其附近的濃度。應(yīng)用的動物血栓模型觀察表明，脂質(zhì)體包裹SK恢復(fù)血管再通的時間只游離SK的50%。凌世長等13應(yīng)用RGDS多肽修飾的脂質(zhì)體包裹尿激酶（UK），利用RGDS與活化血小板表面的纖維蛋白原受體的特異性親和作用，引導(dǎo)脂質(zhì)體溶栓劑的靶向性溶栓效應(yīng)。 脂質(zhì)體靶向攜載溶栓劑為實現(xiàn)導(dǎo)向