大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的少量制備方法及轉(zhuǎn)化條件研究

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是分子克隆的重要試驗(yàn)之一,但目前實(shí)驗(yàn)教材和其他參考書中都采用大量制備感受態(tài)細(xì)胞方法(常規(guī)方法。幾乎所有高等學(xué)校的實(shí)驗(yàn)教材所提供的試驗(yàn)方案中,都需要大容量高速冷凍離心機(jī),有的還要用到超低溫(-80冰箱1。由于普通實(shí)驗(yàn)室缺乏這些設(shè)備,所以該試驗(yàn)很難開(kāi)設(shè)。另外,在實(shí)際操作中,由于感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率受到諸多因素的影響,如離子強(qiáng)度、熱擊參數(shù)、培養(yǎng)條件、保存溫度及時(shí)間等2,轉(zhuǎn)化效率很不穩(wěn)定。很多實(shí)驗(yàn)室采取不同的方法來(lái)提高感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率,但由于這些方法重復(fù)性差或所用藥品昂貴,應(yīng)用并不普遍,而且凍存的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率大大降低。幾年來(lái),筆者經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn),總結(jié)出一種少量制

2、備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并高效率轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的方法,介紹如下。1材料與方法試劑:濃度0.1mol/L CaCl2溶液;100mg/ml氨芐青霉素,均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器:數(shù)顯恒溫水浴搖床(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司; 721分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器公司;恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基,1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉, 1%NaCl,蒸餾水配制;LB固體培養(yǎng)基,1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,1.5%瓊脂粉,蒸餾水配制。1.2方法液,37下振蕩培養(yǎng)至光密度OD600值0.30.6,分別取菌液2 ml于離心管中,冰上放置10min;4000r/min離心10min,去上清,回

3、收細(xì)胞;加冰冷的濃度0.1mol/L CaCl21ml懸浮細(xì)胞,立即置冰上放30min;于4條件下4000r/min離心10min,回收細(xì)胞;用冰冷的濃度0.1mol/L CaCl2600l懸浮細(xì)胞,保存?zhèn)溆?感受態(tài)細(xì)胞冰浴放置4h以上及時(shí)轉(zhuǎn)化,或-70保存,或-20在3周以內(nèi)轉(zhuǎn)化率較高3。粒對(duì)照組,取200l濃度0.1mol/LCaCl2溶液加入裝有100l 質(zhì)粒DNA的離心管中,混勻并在冰上放置30min;將各反應(yīng)管立即放到42循環(huán)水浴12min,取出立即冰浴2min;向各管中分別加入1ml預(yù)熱(37的LB液體培養(yǎng)基,37緩慢振蕩培養(yǎng)1h;將培養(yǎng)液分別均勻涂布在含抗菌素Amp r和不含抗菌

4、素Amp r平板的LB固體培養(yǎng)基上,置于恒溫培養(yǎng)箱中,37培養(yǎng)1216h(先在室溫下正向放置20min,使液體被吸收,再倒置于平皿37培養(yǎng)。若將上述經(jīng)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液鋪板后,長(zhǎng)出的菌落太密,則可進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋后再鋪板,鋪板操作需在無(wú)菌超凈臺(tái)中進(jìn)行,待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng),并統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×(轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的少量制備方法及轉(zhuǎn)化條件研究黃永蓮,黃真池(廣東湛江師范學(xué)院,廣東湛江524048摘要目的提高大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。方法根據(jù)普通實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)條件,總結(jié)出1種少量制備大腸桿菌

5、感受態(tài)細(xì)胞并高效率轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的方法。結(jié)果利用該方法少量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,在OD600nm值為0.30.6時(shí)均可達(dá)到高轉(zhuǎn)化率的效果。與常用的大量制備法相比,該方法的轉(zhuǎn)化率提高100300倍。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單方便、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化效率高、成本低,能夠滿足基因庫(kù)的構(gòu)建、分子克隆等研究的要求,是從事基因克隆研究方面的科研人員的良好選擇。關(guān)鍵詞感受態(tài)細(xì)胞;大腸桿菌;制備;轉(zhuǎn)化中圖分類號(hào)Q939.121文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(200811-04450-02Study on the Mini!preparation Method and Transformation Conditions f

6、or the Competent Cells of Escherichia coliHUANG Yong!lian et al(Zhanjiang Normal College,Zhanjiang,Guangdong524048Key words Competent cell;Escherichia coli;Preparation;Transformation基金項(xiàng)目廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5011730;湛江師范學(xué)院科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(L0607。作者簡(jiǎn)介黃永蓮(1962-,女,重慶人,實(shí)驗(yàn)師,從事分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究。收稿日期2008(02(04(上接第4449頁(yè)酶基因在大腸桿菌中

7、的表達(dá)J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(1:147-152.14張艷禾,張?zhí)m威,胡森,等.Lactobacillus reuteri PYR8亞油酸異構(gòu)酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)J.浙江大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2006,32(5:505-510.15張琳,曹健,陳金朋.微生物亞油酸異構(gòu)酶的生物信息學(xué)分析J.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,28(2:55-59.轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA 加入量同時(shí)比較常規(guī)方法與試驗(yàn)方法的轉(zhuǎn)化效果。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組含抗菌素平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化體,質(zhì)粒對(duì)照組無(wú)受體菌,質(zhì)粒DNA 不能單獨(dú)存活,不長(zhǎng)出菌落;受體

8、菌對(duì)照組在不含抗菌素平板上有大量菌落長(zhǎng)出,在含抗菌素平板上無(wú)菌落長(zhǎng)出,是因?yàn)镋.coli DH5在含抗生素(氨芐青霉素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),說(shuō)明該試驗(yàn)未產(chǎn)生抗藥性突變株;而轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組在兩種條件下都能長(zhǎng)出菌落,是因?yàn)橘|(zhì)粒DNA 具有抗藥(氨芐青霉素性(表1。2.2試驗(yàn)方法與常規(guī)方法轉(zhuǎn)化效果比較表2表明,少量制備大腸桿菌對(duì)感受態(tài)細(xì)胞所選取的OD 600nm 值并不是十分嚴(yán)格,在0.30.6均可達(dá)到高轉(zhuǎn)化率的效果,而常規(guī)方法在轉(zhuǎn)化時(shí)對(duì)感受態(tài)細(xì)胞OD 600nm 值要求嚴(yán)格,一般以氯化鈣法大量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞OD 600nm 值多采用0.400.505。試驗(yàn)組Test group 不含抗菌素平板P

9、late without bacteriophage 含抗菌素平板Plate with bacteriophage受體菌對(duì)照組有大量菌落長(zhǎng)出無(wú)菌落長(zhǎng)出質(zhì)粒對(duì)照組無(wú)菌落長(zhǎng)出無(wú)菌落長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組有大量菌落長(zhǎng)出有菌落長(zhǎng)出表1培養(yǎng)皿內(nèi)各試驗(yàn)組菌落生長(zhǎng)狀況Table 1Colony growth status of each test group in petri dishes質(zhì)粒Plasmid OD 600=0.305OD 600=0.416OD 600=0.503OD 600=0.602常規(guī)方法Conventional method 試驗(yàn)方法Test method 常規(guī)方法Conventional

10、method 試驗(yàn)方法Test method 常規(guī)方法Conventional method 試驗(yàn)方法Test method 常規(guī)方法Conventional method 試驗(yàn)方法Test methodpUC192.01×1062.82×1082.51×1064.16×1082.31×1064.15×1082.02×1062.81×108pGEM1.26×1061.23×1081.69×1062.65×1081.56×1063.18×1081.92

11、15;1061.90×108表2常規(guī)方法和試驗(yàn)方法重復(fù)所得轉(zhuǎn)化率的平均值Table 2Mean of the obtained transformation rate by conventional method and test method使用常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,每微克超螺旋質(zhì)?？僧a(chǎn)生106個(gè)轉(zhuǎn)化菌落,而該試驗(yàn)所用的方法每微克超螺旋質(zhì)?？僧a(chǎn)生108個(gè)轉(zhuǎn)化菌落,轉(zhuǎn)化率提高了100300倍。3結(jié)論與討論(1試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)質(zhì)粒DNA 的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為:感受態(tài)細(xì)胞所選取的OD 600nm 值在0.30.6且感受態(tài)細(xì)胞于-4放置424h 及時(shí)轉(zhuǎn)化,或-20在2周內(nèi)轉(zhuǎn)化效率高;整個(gè)過(guò)程都需置

12、細(xì)胞于冰上,熱休克時(shí)間為12min ,轉(zhuǎn)化是DNA 擴(kuò)增和在體內(nèi)進(jìn)行基因研究的關(guān)鍵步驟。一般認(rèn)為,冰冷氯化鈣溶液處理可使細(xì)菌進(jìn)入“感受態(tài)”,而熱休克則使細(xì)菌的細(xì)胞膜張開(kāi),這樣DNA 得以進(jìn)入細(xì)胞,轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA 濃度為200l ;感受態(tài)細(xì)胞加入質(zhì)粒DNA 2ng 左右,轉(zhuǎn)化率與所加DNA 濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的DNA 量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降6。該試驗(yàn)在轉(zhuǎn)化DNA 時(shí)改用5ml 離心管裝,是因?yàn)榧?xì)菌培養(yǎng)要有一定的空間,在轉(zhuǎn)化后可直接在離心管里加入LB 液體培養(yǎng)基搖勻,無(wú)需另?yè)Q試管,減少操作過(guò)程中的污染。(2一般培養(yǎng)基中必須含有原平板篩選轉(zhuǎn)化子所用的抗生素,以維持對(duì)質(zhì)粒

13、有無(wú)的選擇,部分質(zhì)粒在長(zhǎng)期無(wú)篩選壓力的生長(zhǎng)條件下會(huì)從宿主菌體內(nèi)丟失,因?yàn)槟切┡既粊G失了質(zhì)粒后能以耗能小的方式復(fù)制的細(xì)菌將會(huì)淘汰那些攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌7。(3擴(kuò)增的質(zhì)粒可以用小量法從培養(yǎng)基中制備,通常在這個(gè)時(shí)刻要制備培養(yǎng)物的保存液,方法是將培養(yǎng)物分散于含有一定濃度的甘油溶液中凍存,甘油的作用是保護(hù)細(xì)胞免受冰晶形成的傷害8。(4試劑的質(zhì)量與污染對(duì)試驗(yàn)效果有一定影響,因此,所用的試劑如CaCl 2等應(yīng)是高質(zhì)量的,且最好保存于4的冰箱里。整個(gè)過(guò)程需要注意防止雜菌和其他DNA 的污染,所用器皿如分裝用的微量離心管、吸頭、試劑瓶等都要高壓滅菌,試驗(yàn)中凡涉及溶液移取、分裝等敞開(kāi)實(shí)驗(yàn)器皿的操作,最好在無(wú)菌超凈臺(tái)中

14、進(jìn)行以防污染9。(5該方法放寬了試驗(yàn)條件,OD 600nm 值在0.30.6均可得到較高的轉(zhuǎn)化率,能夠滿足基因庫(kù)的構(gòu)建、分子克隆等研究,相對(duì)于電擊轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好;相對(duì)于高感受態(tài)細(xì)胞制備,節(jié)約了試驗(yàn)成本;相對(duì)于經(jīng)典氯化鈣法簡(jiǎn)化了操作流程、節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間,是從事基因克隆研究方面科研人員的良好選擇。參考文獻(xiàn)1張嵐嵐,徐春燕,徐昌杰.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響因素J.細(xì)胞生物學(xué)雜志,2004(26:429-432.2謝志雄,劉義,陳向東,等.大腸桿菌HB101感受態(tài)的熱化學(xué)研究J.化學(xué)學(xué)報(bào),2000,58(2:153-156.3涂知明,陳明潔,何光源,等.三種大腸桿菌高效感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化J.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,34(4:112-115.4劉進(jìn)元.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.北京:清華大學(xué)出版社,2002:22-29.5魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.北京:高等教育出版社,1999:51-55.6李振宇,徐開(kāi)林,潘秀英,等.氯化銣法