多色熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)雜核型異常

1、多色熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)雜核型異常             作者：李建勇，馬力，肖冰，潘金蘭，仇海榮，吳亞芳，溫丙昭，薛永權(quán)【摘要】  本研究建立多色熒光原位雜交（M-FISH）技術(shù)平臺(tái)，探討其在檢測(cè)急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法和M-FISH技術(shù)分析了5例伴有復(fù)雜核型異常的ALL患者。結(jié)果表明：M-FISH 證實(shí)了原有的異常t(9；22)、t(1；19)和 t(y；1)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了新的異常der(

2、1)(137)、der(6) t(6；9)(q?；p13)、der(1)t(1；11)、der(12)t(1；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)、der(9)(9187)和der(7)(9187)，并且糾正了原有的錯(cuò)誤分析，其中der(9)(9187)及der(7)(9187)為世界上首例報(bào)道。結(jié)論：M-FISH在檢測(cè)ALL復(fù)雜核型中的應(yīng)用前景廣闊，是進(jìn)行精確染色體核型分析所不可缺少的先進(jìn)手段。 【關(guān)鍵詞】  多色熒光原位雜交Detection of the Complex Chromosomal Aberrations in Acute Lymphobla

3、stic Leukemia by Means of  Multiplex Fluorescence in situ HybridizationAbstract  This study was aimed to establish the technique of multiplex fluorescence in situ hybridization (M-FISH) and to explore its usefulness in detection of complex chromosomal aberrations (CCAs) in acute lymphoblas

4、tic leukemia (ALL). Five ALL patients with CCAs were analyzed by combining the techniques of conventional cytogenetics (CC) and M-FISH. The results demonstrated that M-FISH confirmed the aberrations  previously detected by CC，such as t(9；22)，t(1；19) and t(y；1)，and revealed new abnormalities

5、0; as der(1)(137)，der(6)t(6；9)(q?；p13)，der(1)t(1；11)， der(12)t(1；12)，der(3)t(3；5)，der(2)t(2；16)，der(9)(9187) and der(7)(9187)，and also corrected the wrong results in CC. Among these abnormalities，der(9)(9187) and der(7)(9187) were  reported for the first time. In conclusion，M-FISH has proved to

6、 be useful in characterization of the CCAs in ALL，and it is an essential method to refine the karyotype analysis.Key words  multiplex fluorescence in situ hybridization；acute lymphoblastic leukemia；complex chromosomal aberration伴隨血液系統(tǒng)疾病WHO分型的提出，細(xì)胞遺傳學(xué)已被提升到了更重要的地位。但是常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法對(duì)微小染色體重排或復(fù)雜核型分析效果較差，而

7、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)又只能用1-2種探針來檢測(cè)證實(shí)已知的異常。這兩種方法都難以識(shí)別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)改變和標(biāo)記染色體的來源。多色熒光原位雜交 （multiplex-FISH，M-FISH）技術(shù)1則可以有效的解決上述難題。M-FISH技術(shù)在國(guó)外開展應(yīng)用相對(duì)較多，但國(guó)內(nèi)僅有趙萌等2應(yīng)用 M-FISH 技術(shù)檢測(cè)了2例急性白血病患者的核型異常。我們應(yīng)用M-FISH技術(shù)對(duì)5例伴有復(fù)雜核型異常（complex chromosomalberrations，CCAs）的急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leu

8、kemia，ALL）病例進(jìn)行了檢測(cè)，以探討該技術(shù)在檢測(cè)ALL復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用。材料和方法研究對(duì)象5例ALL患者，男4例，女1例，診斷和分型根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫分型和染色體核型分析確定，出現(xiàn)的染色體異常累計(jì)2個(gè)以上染色體和（或）3個(gè)以上斷裂位點(diǎn)。例正常男性作為對(duì)照。細(xì)胞遺傳學(xué)分析采用骨髓短期培養(yǎng)法，按常規(guī)制備染色體。應(yīng)用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析，核型異常按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN）1995加以描述。M-FISH分析M-FISH 探針為 Vysis 公司提供，以聯(lián)合標(biāo)記的方式共標(biāo)記SpectrumAquaTM、SpectrumGreenTM、Spectr

9、umGoldTM、SpectrumRedTM、  SpectrumFRedTM 5種熒光素，用SpectraVysion 分析系統(tǒng)分析可得出24種不同的色彩分別標(biāo)記于每一條染色體上。M-FISH的具體步驟  取出儲(chǔ)存于-20的染色體標(biāo)本，氣干法滴片，自然干燥后放入37 2×SSC中老化30分鐘； 分別用RNA酶、胃蛋白酶及甲醛消化處理玻片，具體時(shí)間隨玻片上細(xì)胞多少及胞漿多少而定，用相差顯微鏡觀察確定； 72、70%甲酰胺/2×SSC變性玻片2分鐘，室溫乙醇梯度脫水待干； 取出10 微升/1張玻片量的探針，72水浴5分鐘；加探針10 l于玻片上，上蓋22

10、mm×22 mm蓋玻片，四周封膠，放入濕盒中37雜交12-18小時(shí)；第2天，取出玻片，揭去蓋玻片，放入72 0.4×SSC/0.3% Tween-20中洗片2分鐘，再放入室溫2×SSC/0.1% Tween-20中洗片1分鐘，待干； 加DAPI III 10 l 復(fù)染，1小時(shí)后看片。系統(tǒng)分析采用SpectraVysion 分析系統(tǒng)及Leica DRMA2型熒光顯微鏡，按照順序換用 5 種濾光片，每一個(gè)分裂象分別于SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM 、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM濾光

11、片下采集5種熒光素的原始圖象，軟件分析合成最后的分類圖象，即每一條染色體被賦予一種偽彩（共24色），每一份標(biāo)本均采集約20個(gè)分裂象。結(jié) 果5例ALL患者具體情況見附表。    例正常男性對(duì)照的常規(guī)染色體和M-FISH均顯示正常男性核型：46，XY。5例ALL患者的中期分裂相較多，染色體分散好，故采集后合成的圖象效果較好。例1與例2均有t(9；22)易位，已預(yù)示預(yù)后較差，但因其還具有其他復(fù)雜異常，經(jīng)M-FISH檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，例1具有der(1)(137)、der(6)t(6；9)(q?；p13)；例2則具有多個(gè)復(fù)雜異常：der(1)t(1；11)、der(12)t(1

12、；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)；例3為一超二倍體ALL患者，具有復(fù)雜異常，但因常規(guī)顯帶效果較差，未分清是何種異常，經(jīng)M-FISH證實(shí)為der(9) (9187)×2與der(7)(9187)×2；例4的M-FISH與常規(guī)核型分析相同，未發(fā)現(xiàn)新的異常；例5的常規(guī)核型分析發(fā)現(xiàn)較復(fù)雜，為47，XY，-4，11q-，14q+，der(15)，der(17)，+mar1，+mar2，但M-FISH結(jié)果證實(shí)為48，XY，+1，t(1；14)(p32；q31)×2，+der(2)，-4，+der(7)，del(11)(q14)。例正常對(duì)照和5例患

13、者的M-FISH圖形見附圖。 Table. CC and M-FISH features of five ALL patients（略）百事通 討  論眾所周知，細(xì)胞遺傳學(xué)對(duì)急性白血病患者的預(yù)后起重要作用，是急性白血病最重要的預(yù)后因素之一。但急性白血病患者的染色體制備較難，尤其是ALL患者，染色體易成團(tuán)、成像粗糙、顯帶不清，常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析較困難。若ALL患者為CCAs，則分析更為困難。但是我們需要明確CCAs，以便將其分為不同的細(xì)胞遺傳學(xué)亞型以指導(dǎo)治療，判斷預(yù)后。    目前，國(guó)際上開展M-FISH技術(shù)來明確急性白血病患者的CCAs。M-FISH技術(shù)

14、是應(yīng)用5種熒光素同時(shí)標(biāo)記人類24條染色體，制備整套染色體涂抹探針，與待測(cè)病例的中期染色體分裂象進(jìn)行雜交，雜交后應(yīng)用配備有CCD冷式攝像系統(tǒng)與計(jì)算機(jī)圖象處理系統(tǒng)等裝置的熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。M-FISH通過一次雜交即可檢測(cè)整套人類染色體的所有異常。    M-FISH在確定CCAs中起了重要作用，如確定復(fù)雜的結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常，揭示隱匿易位，查明標(biāo)記染色體的來源等1-3。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)ALL患者的研究尚不多。我們已知10%-34%的原發(fā)性AML患者與26.6%的兒童ALL患者中存在CCAs4，5，但尚不清楚CCAs在成人ALL患者中所占比例。因此，我們應(yīng)用M-FISH技術(shù)檢

15、測(cè)5例伴有CCAs的ALL患者，以探討M-FISH在檢測(cè)ALL復(fù)雜核型中的價(jià)值，為今后研究ALL的復(fù)雜核型異常建立一扎實(shí)的技術(shù)平臺(tái)。    通過本研究，我們建立了較穩(wěn)定的M-FISH技術(shù)平臺(tái)，成功地分析了5例ALL患者。這5例ALL患者均伴有CCAs，經(jīng)M-FISH檢測(cè)，證實(shí)了原有的異常，如t(9；22)、t(1；19)、t(y；1)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了新的異常，如der(1)t(137)、der(6)t(6；9)(q?；p13)、der(1)t(1；11)、der(12)t(1；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)、der(9)(9187)和d

16、er(7)(9187)，其中der(9) (9187)及der(7)(9187)為目前世界上首例報(bào)道的核型異常。    M-FISH不僅發(fā)現(xiàn)與證實(shí)了常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果，還糾正了原有的錯(cuò)誤分析。例5經(jīng)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果為47，XY，-4，11q-，14q+，der(15)，der(17)，+mar1，+mar2，但M-FISH檢測(cè)結(jié)果證實(shí)為48，XY，+1，t(1；14)(p32；q31)×2，+der(2)，-4，+der(7)，del(11)(q14)。    M-FISH在檢測(cè)過程中，不需要事先知道是否存在異常，而一

17、次檢測(cè)約2天時(shí)間，就可以檢測(cè)4份標(biāo)本，省時(shí)、省力，實(shí)現(xiàn)了核型分析自動(dòng)化。因此我們認(rèn)為M-FISH在檢測(cè)ALL復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用前景廣闊。    但是，通過本研究我們也發(fā)現(xiàn)了M-FISH技術(shù)的局限性，為此提出了一些相應(yīng)改進(jìn)要求：染色體分散要好，數(shù)量應(yīng)較多，對(duì)質(zhì)量要求高，但單個(gè)染色體可以毛糙。因此氣干法滴片時(shí)，可選用4，95%乙醇泡過的玻片，滴片時(shí)玻片與滴管的距離盡量長(zhǎng)；M-FISH對(duì)染色體內(nèi)的改變?nèi)绫蹆?nèi)倒位，小的片段的缺失與重復(fù)檢測(cè)效果較差。對(duì)上述異常需要結(jié)合常規(guī)顯帶技術(shù)或比較基因組雜交技術(shù)來確認(rèn)。    總而言之，M-FISH技術(shù)能

18、夠明確ALL患者的復(fù)雜核型異常，并且真正實(shí)現(xiàn)了核型分析的自動(dòng)化，應(yīng)用前景廣闊，它已成為精確染色體核型分析所不可缺少的先進(jìn)手段。 【參考文獻(xiàn)】  1 Liehr T，Srarke H，Weise A，et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol Histopathol，2004；19: 229-2372趙萌，陳冰，王璐等. 多重?zé)晒庠浑s交技術(shù)體系的建立及其在檢測(cè)白血病復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2002；19:375-3783Langer S，Kraus J，Jentsch I，et al. Multicolor chromosome pain- ting in diagnostic and research applications. Chromosome Res，2004；12:15-234van-Limbergen H，Poppe B，Michaux L，et al. Identification of cytogenetic subclasses and recurring chromosomal aberrati