板栗和錐栗同域居群的空間遺傳結構

1、板栗和錐栗同域居群的空間遺傳結構朱蕾1,2，康明3*(1. 中國科學院武漢植物園, 武漢 430074; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049; 3. 中國科學院華南植物園, 中國科學院植物資源保護與可持續(xù) 利用重點實驗室, 廣州 510650)摘要: 采用微衛(wèi)星技術研究了板栗(Castanea mollissima)和錐栗(C. henry i)同域分布居群的空間遺傳結構, 探討了它們的遺傳變異空間分布特征及其形成機制。結果表明，采用的 7 個微衛(wèi)星在兩物種中共擴增出 173 個等位基因，兩物種都具有較高的遺 傳多樣性且種間遺傳分化水平較低(F ST = 0.051), 但空間自相

2、關分析揭示板栗和錐栗在同域居群中具有不同的空間遺傳結構， 錐栗在 100 m 內有空間遺傳結構，而板栗沒有; 同時，基于親緣關系系數(shù) F ij 的 Sp 統(tǒng)計值也顯示錐栗具有比板栗更強的空間遺 傳結構(板栗的 Sp = 0.002; 錐栗的 Sp = 0.018)。居群遺傳變異的空間結構是其傳粉和種子散播及生境共同作用的結果，其中 種子的近距離散播和居群密度可能是主要的因素。板栗和錐栗居群在小尺度上空間遺傳結構的差異可能反映了它們種子的 大小及擴散過程的差異。關鍵詞:板栗; 錐栗; 微衛(wèi)星; 空間遺傳結構; 遺傳多樣性doi: 10.3969/j.issn.10053395.2012.01.0

3、01SpatialGeneticStructureofASympatricPopulationofCastaneamollissima and Castanea henryiZHU Lei1,2 , KANG M ing3*(1. Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Key Laboratory of Plant Resou

4、rces Conservation and Sustainable Utilization, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)Abstract:The spatial genetic structure (SGS) is an important part of evolutionary ecological and ecological geneticprocesses in natural populations of plants. The spatial

5、 distribution patterns of genetic variation of two closelyrelated sympatric Castanea species, C. mollissima and C. henryi, were investigated using seven microsatellite loci. Atotal of 173 alleles were detected in the two species. According to the isolation by distance model, Sp -statistics werecalcu

6、lated based on M oran's I spatial autocorrelation coefficient and F ij kinship coefficient for the two speciesTheresults showed that there were high polymorphism in each species with low genetic differentiation ( FST = 0.051 ).However, the two species displayed significant difference of SGS in t

7、his sympatric population. Spatial genetic structure was detected in C. henryi up to 100 m, while that was not observed in C. mollissima. M oreover, the Sp - statistic values based on F ij , were 0.002 for C. mollissima and 0.018 for C. henryi. These results further supported that C. henryi had stron

8、ger spatial genetic structure than C. mollissima. The difference of SGS in C. mollissima and C. henryi can be explained by different seed characteristics, as C. mollissima was charactertized by three nuts per cupule while there was only one nuts per cupule for C. henryi. Therefore, the long-distance

9、 seed dispersal via gravity and animals was much more favored for C. mollissima than C. henryi, which reduced different SGS between the two species.Key words:Castanea mollissima; Castanea henry i; SSR; Sp atial genetic structure; Genetic diversity收稿日期: 20110509接受日期: 20110602基金項目:國家自然科學基金項目(30770219)

10、; 中國科學院重要方向性項目(KSCX2 YW N061)資助作者簡介: 朱蕾(1987 ) , 女, 碩士研究生, 從事栗屬植物保育遺傳學研究，email: zhuleiahsd* 通訊作者 Corresp onding author, email: mingkang 2熱帶亞熱帶植物學報第 20 卷栗屬(Castanea M iller) 是殼斗科(Fagaceae) 中較小的屬，全世界有 7 種，廣泛分布于北半球溫帶地 區(qū)1。其中，亞洲分布有 4 種: 板栗 (C. mollissima Bl.)、茅栗(C. seguinii Dode) 和錐栗(C. henry i Rehd.&

11、; Wils.)分布在中國大陸; 日本栗(C. crenata Sieb. & Cuce)分布在日本和朝鮮半島。板栗為落葉喬木， 成熟葉片葉背密被灰白色星狀毛，通常 1 個殼斗中 含有 3 個堅果，雌雄異花同株，風媒異花傳粉，在中 國秦嶺以南從漢水到長江中下游沿岸的丘陵山區(qū) 有野生居群分布。 中國板栗因其品質好、抗逆性 強、遺傳資源豐富而被廣泛地作為經(jīng)濟植物栽培。 錐栗為落葉大喬木，葉片有光澤，背面光滑，堅果單 生，雌雄異花同株，風媒異花傳粉，自然分布于秦 嶺、淮河以南地區(qū)。錐栗僅在福建、浙江等局部地 區(qū)作為經(jīng)濟植物栽培2。居群遺傳結構及其影響因子的研究是保護遺 傳學的重要內容，它不僅

12、是探討物種形成以及植物 適應性進化機制的基礎，也是制定物種有效保護策 略和 措 施 的 依 據(jù)3。 空間自相關分析 ( sp atial autocorrelation analy sis, SGS) 是研究居群空間遺傳 結構的一種有效方法，尤其是在小尺度空間范圍 內，用來檢測與量化從多個標定點中取值變異的空 間依賴性，通過檢測一個位置上的變異是否依賴于 鄰近位置的變異來判斷該變異是否存在空間自相 關性，即是否存在空間結構47。近年來，居群空間 遺傳結構分析已經(jīng)成為分子生態(tài)學和保育遺傳學 研究的重要手段。王英等8 用 9 對 SSR 引物對茅 栗隨機大居群以及其中各亞居群的遺傳結構進行 了空間

13、自相關分析。Cottrell 等9采用 SSR 標記技 術對夏櫟(Quercus robur)和無梗櫟(Q. p etraea)的兩 個不同干擾程度居群的小格局空間遺傳結構進行 了分析，結果表明這兩種櫟樹在同一居群及同一樹 種在不同居群均表現(xiàn)出不同的空間遺傳結構，可能 與物種不同的種子擴散機制和人類活動對居群的 空間遺傳結構的影響有關。這些研究表明植物居 群的空間遺傳結構受基因流、微生境選擇、居群聚 集情況、生活史和人類活動等因素影響。迄今為止，大多數(shù)空間遺傳結構分析均是對單 個物種的居群開展的，而對于多個物種同域居群的 空間遺傳結構分析則少有報道。在同域居群中，物 種所處的生境特征基本一致，

14、物種間空間遺傳結構 的差異更能反映物種的擴散特征，而排除環(huán)境因素 的影響。本研究以湖北省秭歸縣境內一同域居群中的板栗和錐栗為研究對象，采用微衛(wèi)星分子標記技術及空間自相關分析方法，探討同域居群中板栗 和錐栗是否存在空間遺傳結構及其形成原因，為研 究它們的適應性進化機制和制定有效的保護策略 和措施提供科學依據(jù)。材料和方法11 1 樣本采集和 DNA 提取選取湖北省秭歸縣楊林橋鎮(zhèn)境內的一個板栗 (C. mollissima)和錐栗(C. henry i)的自然同域分布居 群作為采樣地 (30° 43' N, 110° 48' E，海拔 1100 1200 m)。樣

15、地面積約為 12 hm2 ; 屬亞熱帶季風性 濕潤氣候，年平均降水量 990 1400 mm，雨熱同季; 年平均氣溫 13 18.5 , 1 月(最冷月)平均氣 溫為 4.7 ，7 月(最熱月)平均氣溫為 27.9 ，無霜期273 d; 10 的年積溫為 3000 6080 ; 土壤類 型為黃棕壤，呈弱酸性，土層較厚，自然肥力較高;植被類型為針闊混交林及山地灌叢，主要的伴生種 為 栓 皮 櫟 ( Q. variabilis ) 和 杉 木 ( Cunninghamialanceolata)。野外對樹形、樹皮、葉片、胸徑、開花情況等性 狀進行觀察，對同域分布的板栗和錐栗的所有成年 個體進行取樣和

16、定位。共采集和定位了 450 株個 體，其中板栗 168 株, 錐栗 282 株(圖 1 )。每個植株 均選取樹冠上部表層的 5 片無破損且完全展開的 成熟葉片，采集的葉片立即用硅膠干燥保存。葉片10的 DNA 提取采用改良的 CTAB 法1 2 微衛(wèi)星熒光標記分析。在前期實驗的基礎上，本研究選用了 7 對多態(tài)性較好的 SSR 引物，其中 5 對來自歐洲栗(C. sativa)的 引 物 ( CsCAT3、CsCAT5、CsCAT8、CsCAT14、10CsCAT41) 和 2 對來自日本栗的引物(KT001b 和12KT008a) ，由寶生物工程公司合成。采用 FAM 、TAM RA 和 H

17、EX 等 3 種不同顏色的熒光染料對 SSR 正向引物的 5' 端分別進行標記。DNA 擴增中 各引物的 PCR 反應條件和程序參照田華等13的方 法。擴增反應總體積為 15 L，包括 1.5 L 10 × buffer，1.5 mmol/L M gCl2 0.9 L，0.5 mol/L 的正反 向引 物 各 0. 75 L，200 mol/L dNTP 0. 3 L，0.5 U L 1 Taq DNA 聚合酶(生工生物工程有限公 司合成) 0.3 L 和 50 ng 模板 DNA。PCR 擴增條件 為: 95 預變性5 min，然后 94 50 s，每對引物的 特定退火溫度

18、 30 s，72 90 s，共 35 次循環(huán)，最后朱蕾等: 板栗和錐栗同域居群的空間遺傳結構第 1 期3圖 1 秭歸板栗和錐栗同域居群的個體分布Fig. 1 Individual distribution of Castanea mollissima and C. henry i sy mp atric p op ulation in Zigui72 7 min 延伸。擴增反應在 M aster Gradient PCR儀(Ep p endorf, Germany ) 上進行。將不同顏色標記 引物或目標片段至少隔50 bp 相同顏色標記引物的 PCR 產(chǎn)物混合一起，通過毛細管電泳，在 ABI

19、3730DNA 分析儀上進行區(qū)分。1 3 數(shù)據(jù)分析1.3.1 遺傳多樣性采用 GenALEx6 軟件14計算遺傳多樣性參數(shù): 每個位點的等位基因頻率、每個位點的等位基因數(shù) (A O )、每個位點的有效等位基因數(shù)(A E )、觀察雜合度(H O ) 和 預 期 雜 合 度 ( H E )、居 群 分 化 系 數(shù) Wright'sFST ?？ǚ綑z測 Wright's 近交系數(shù) FIS 可反映每個位點是否偏離 Hardy -Weinberg 平衡15。1.3.2 空間自相關分析通過 計 算 每 個 位 點 的 M oran's I 統(tǒng) 計 值 和最少要有 30 個單株對。在多

20、態(tài)性位點中選取基因頻率在 10% 90% 的位點, 頻率小于 10% 和大于90% 的等位基因被排除, 是因為它們僅僅代表非常 少的個體, 不能提供足夠的信息16。采用 SPAGEDI171.3軟件計算不同距離等級下的空間自相關系數(shù)Moran's I。同時，用基于多位點親緣關系的方法計算 每個采樣點內兩兩個體間的空間自相關系數(shù) Nason's18值(Fij ) ，該參數(shù)描述了個體 I 和 J 之間相對于居群內隨機取樣個體間平均遺傳相似性的遺傳相似程度。1.3.3 Sp 統(tǒng)計值分析Sp 統(tǒng)計值可以用來檢測物種空間遺傳結構的 強度，它的優(yōu)點是對取樣的尺度及居群是否滿足漂1920變-

21、擴散-突變平衡不敏感 ，因而有利于物種間的比較。Sp = b/(F1 1)，其中 F1 表示第一距離等級 內個體間的親緣系數(shù)，b 是親緣關系對距離的自然 對數(shù)的回歸斜率。物種的空間遺傳結構采用軟件 SPAGEDI 1.3 進行分析。在本研究中，我們采用空 間自相關系數(shù) Nason's 值(Fij )計算 Sp 統(tǒng)計值，因為45Nason's 值(Fij )檢測空間自相關程度 。按照物種內單株間的距離，距離等級采用 50 m，每個物種劃分12 個等級。為保證分析的準確性，每個距離等級內4熱帶亞熱帶植物學報第 20 卷與其它參數(shù)相比，Nason's 值(Fij )的統(tǒng)計偏差

22、較小，具有較強的統(tǒng)計分析特性。和 2.9，觀察雜 合 度 (H O ) 分 別 為 0. 387 0. 940 和0.174 0.819，預期雜合度(H E )分別為 0.573 0.843和 0.217 0.789。板栗的平均觀察雜合度和平均預期雜合度(0.655 和 0.720 )均高于錐栗的(0.561 和 0.566)。兩物種均有少數(shù)位點偏離 Hardy -Weinberg平衡。板栗的平均近交系數(shù)(FIS ) 為0.095，錐栗為0.024(表 1)。在多位點分析中，板栗和錐栗中都有輕微的雜合度不足。 同時，兩物種間的分化系數(shù)(FST = 0.051)較低。結果22 1 遺傳多樣性分析

23、7 對熒光標記微衛(wèi)星引物在同域居群兩個物種 中共擴增出 173 個等位基因，板栗和錐栗分別擴增 出 69 和 104 個等位基因，有 52 個等位基因是兩物 種共有的。板栗和錐栗的平均等位基因數(shù)(A )分別 是 9.9 和 14.9，平均有效等位基因數(shù)(A E )分別是 4.0表 1 同域居群的 SSR 位點多樣性檢測Table 1 SSR locus diversity measures in sy mp atric p op ulationAA EH EH OF IS引物 PrimerCMCHCMCHCMCHCMCHCMCHCsCAT3CsCAT5CsCAT8CsCAT14CsCAT41K

24、T001b11191010582220141216116.45.43.15.02.83.23.64.73.14.01.31.30.8430.8160.6760.8010.6460.6830.7190.7890.6780.7520.2400.2170.8100.6470.9400.7490.5060.5330.6640.6800.8190.7720.1740.2200.0390.207 0.3900.0660.2170.2190.0760.139 0.208 0.0270.273 0.015 0.0690.024KT008a平均 M ean692.32.30.5730.5700.3870.609

25、0.3259.914.94.02.90.7200.5660.6550.5610.095CM : 板栗; CH: 錐栗; A: 等位基因數(shù); A E : 有效等位基因數(shù); H E : 預期雜合度; H O : 觀察雜合度; F IS : 近交系數(shù)。CM : Castanea mollissima; CH: Castanea henry i; A: Number of alleles p er locus; A E : Effectine number of alleles p er locus; H E : Exp ected heterozy gosity ; H O : Observed h

26、eterozy gosity ; F IS : Inbreeding coefficient .和 Fij 值。結果表明，無論采用哪種統(tǒng)計值，板栗的基因型分布均呈隨機分布模式，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的空間遺傳結構(圖 2a,3a)。錐栗的基因型在 100 m 內2 2 空間遺傳結構在板栗和錐栗的同域居群中劃分 12 個距離等 級，每個等級相隔 50 m，計算各個位點的 M oran's I圖 2 板栗(a)和錐栗(b)在不同距離上的 M oran's I 值。實線為觀察數(shù)據(jù)，每個距離等級的 95% 的上下置信區(qū)間用虛線表示。下圖同。Fig. 2 M oran's I of Cas

27、tanea mollissima (a) and C. henry i (b) at different distance. The solid lines indicate observed data, while dotted lines indicate about 95% confidence interval for each distance class. The same as following Figure.朱蕾等: 板栗和錐栗同域居群的空間遺傳結構第 1 期5圖 3 板栗(a)和錐栗(b)在不同距離上的 F ij 值Fig. 3 Kinship coefficient (F

28、 ij ) of Castanea mollissima (a) and C. henry i (b) at different distance之間幾乎沒有自然雜交23。因此，板栗和錐栗居群之間較低的分化更可能反映了這兩個物種保持 了 共 有 的 祖 先 多 態(tài) 性 ( Shared ancestral p oly morp hisms)。這種情形在櫟屬(Quercus )自然雜 交帶的遺傳分化研究中也有報道24。3 2 空間遺傳結構遺傳變異的空間分布過程中基因型的選擇是 一種距離隔離作用，個體間的親緣關系隨距離的增 加而降低。基因型的非隨機分布是形成居群內空 間遺傳結構的主要因素。本研究結

29、果表明錐栗在100 m 的范圍內有著明顯的空間遺傳結構，但板栗 則沒有顯著的空間遺傳結構(圖 2,3 )。同域居群近 緣物種表現(xiàn)出不同的空間遺傳結構的現(xiàn)象在其他 一些物種中也有報道，Soto 等25 采用微衛(wèi)星標記 對冬青櫟(Q. ilex)和栓皮櫟(Q. suber)的空間遺傳結 構進行了分析，結果表明冬青櫟在 75 m 的范圍內 有顯著的空間結構，而栓皮櫟則沒有。然而，呈現(xiàn) 顯著空間遺傳結構的距離大小很大程度上依賴于 取樣尺度的變化，因此，該參數(shù)并不能有效地反映 物種的空間遺傳結構17,26。相反，Sp 統(tǒng)計值反映 的居群空間遺傳結構強度并不依賴于取樣的策略， 可以用于不同居群或不同 物

30、種 的 比 較1718。 Vekemans 等17分析了 47 種植物的 Sp 統(tǒng)計值，結 果表明風媒及重力/動物擴散的樹種其空間遺傳結 構強度約為 0.003 0.123。可以看出，中國栗屬植 物的空間遺傳結構與已報道的具有類似生活史特 征物種的空間遺傳結構相吻合，不過，板栗的空間 遺傳結構屬于較低水平。值得注意的是，盡管該同域分布居群中栗屬兩 種植物的空間遺傳結構均較低，但錐栗的空間遺傳呈現(xiàn)非隨機分布(圖 2b,3b)，隨著距離的增加個體間的相關性逐漸降低，表明在 100 m 內的個體間親緣 關系相近，而 100 m 以外的植株遺傳變異則越來越 不相似。板栗和錐栗基于多位點親緣關系個體空間

31、自相關系數(shù) Fij 的 Sp 值分別為 0.002 和 0.018，也 表明在同域居群中錐栗的空間遺傳結構強于板栗。討論33 1 同域居群板栗和錐栗的遺傳多樣性本研究結果表明來自歐洲栗和日本栗的微衛(wèi)星 引物在板栗和錐栗中都具有很好的通用性，但擴增 片段大小在物種間稍有差異。7 對微衛(wèi)星引物在板 栗中表現(xiàn)出了高于錐栗的多態(tài)性,預期雜合度和觀察 雜合度(板栗的 HE 為 0.720, HO 為 0.655; 錐栗的 HE21為 0.566, HO 為 0.561)，均高于郎萍等用等位酶的研究結果(板栗的 HE 為 0.311, HO 為 0.284; 錐栗的8HE 為 0.261, HO 為 0.

32、218)。同時，王英等報道茅栗居群的 A 為 10, HO 為 0.355 0.817, HE 為 0.637 0.879，田華等13 報道板栗居群的 A 為7.4, H 為O0.590，HE 為 0.678，本研究中板栗和錐栗的遺傳多樣性水平與他們的結果相差不大。這與栗屬植物生活 史特征相符合，栗屬植物均為多年生長壽命植物，在我國廣域分布，雌雄同株但卻幾乎不能自交，具有風 媒異花授粉的繁育特 性，花粉能夠傳播較遠的 距離22。本研究中，板栗和錐栗共享 52 個等位基因，且 兩物種的遺傳分化程度較低但明顯。由于板栗和 錐栗在人工條件下可雜交，因此它們的低分化可能 是因為種間的基因流低導致的。不

33、過，我們先前對 這個同域居群葉表型變異的研究表明，板栗和錐栗6熱帶亞熱帶植物學報第 20 卷結構水平(Sp = 0.018 )卻遠遠高于板栗(Sp = 0.002 )。同樣，Valbuena-Carabana 等27利用 9 個高多態(tài)性的 SSR 分子標記對 3 個不同分布密度和生境的無梗 櫟(Q. p etraea)和比利牛斯櫟(Q. p y renaica)的混合居群進行了小尺度空間結構的研究，結果表明在相同居群內無梗櫟具有比比利牛斯櫟更強的空間遺傳 結構。在小尺度空間水平上，有限的基因擴散是居 群空間遺傳結構形成的最主要原因17。基因擴散 包括種子和花粉的傳播，但多數(shù)研究結果表明，種 子

34、的傳播比花粉傳播更容易影響植物的空間遺傳 結構3,28。因此種子擴散差異可能是導致板栗和錐 栗空間遺傳結構差異的主要原因。栗屬植物種子 主要依靠重力或附著傳播，有報道認為嚙齒類動物 是櫟子、山毛櫸堅果或榛子的主要擴散者，它們在 種子的次級擴散中扮演重要的角色29。嚙齒動物 通常取食較大的植物種子或果實，一方面因為較大 的種子或果實內富含營養(yǎng)物質，如淀粉、脂肪、蛋白 質以及其它營養(yǎng)物質，是嚙齒動物等的重要食物資 源; 另一方面，比較大的種子或果實在自然界中能 很好貯藏，通常不易腐爛變質30。板栗 1 個殼斗中 含 3 個堅果，果實較大，因此板栗的種子或果實被 動物擴散的機會較大，使得遠離母樹貯藏

35、的種子比 在樹冠下萌發(fā)的堅果受到較小的競爭，有利于生 長; 而錐栗種子堅果單生果實較小，被動物散播的 可能較少，大部分種子易在母樹附近形成家系結 構，這種聚集分布導致了錐栗具有一定的空間遺傳 結構。此外，板栗和錐栗具有類似的生活史特征， 即都是風媒傳粉，花粉可以遠距離擴散。 一般來 講，花粉擴散的距離與居群密度成負相關，這一現(xiàn) 象在很多風媒森林樹種中都有報道3133。在該同 域分布居群內，錐栗的高密度分布可能也一定程度 上限制了花粉的擴散距離，進一步增加了其空間遺 傳結構強度?？臻g遺傳結構分析極大地拓展了遺傳學在保 護生物學研究中的應用范圍，是將居群遺傳學理 論、種群統(tǒng)計學方法與景觀生態(tài)學研究

36、相結合的重 要一環(huán)34。本研究揭示了在板栗和錐栗的同域居 群中，錐栗比板栗具有更明顯的空間遺傳結構，這 可能反映了兩個物種在種子擴散和花粉散布能力 上的差異，不過我們還不能完全定量地估測這些影 響因素在物種遺傳結構中所起作用的大小及其后 果。后續(xù)研究可以采用親本分析的方法揭示花粉 和種子在居群中的實際擴散距離，并考察其對空間遺傳結構的影響。參考文獻1Johnson G P. Revision of Castanea sect . Balanocastanon(Fagaceae) J. J Arn Arb, 1988, 69(1): 2549.Huang C C(黃成就), Chang Y T

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