同時檢測豬瘟病毒和北美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的復(fù)合熒光定量RT-PCR方法的建立

1、 1期 成 丹等 : 同時檢測豬瘟病毒和北美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的復(fù)合熒光定量 RT - P CR 方法的建立 4 77 3 1 3 復(fù)合熒光定量 RT -PCR 方法的影響因素和改 進措施 熒光定量 RT- PCR 對探針要求非常高, 如果探 針不夠特異 , 會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。在復(fù)合熒光定 量 RT- P CR 中 , 由于使用了多種不同熒光標(biāo)記的探 針, 可能會出現(xiàn)競爭性抑制作用, 從而影響到檢測的 準(zhǔn)確性和敏感性 , 為了減少這種影響, 要合理設(shè)計引 物和探針 , 特別是設(shè)計 探針時, 要盡量避開發(fā) 夾結(jié) 構(gòu), 退火溫度不能太高或太低 , 以避免探針與探針以 及引物與引物之間的雜

2、交 11 - 12 DENG M Y , W A N G H, W AR D G B, et a l. Compariso n o f six R N A ex traction met ho ds fo r the detec tion o f classical sw ine fev er vir us by real time and co nv entional rever se t ranscr iption - P CR J . J Vet Diagn I nvest , 2005, 17( 6 : 574 - 578. 5 ZH A O J J, CH EN G D , L I

3、N , et al. Evaluat ion of a multiplex real time RT- PCR for quantitative and differentia l detection o f w ild - ty pe viruses and C - str ain v accine o f Classical sw ine fever v irus J . Vet M icr o biol , 2008, 126( 1 -3 : 1 - 10. 。研究中發(fā)現(xiàn), 探針 6 K L EIBOEK ER S B, SCH O M M ER S K , L EE S M , et

4、al. Simultaneo us detection o f N o rth A merican and Euro pean po rcine r eproductive and respirato ry syndro me v ir us using r eal time quantitativ e rever se transcriptase - PCR J . J V et D iagn I nvest , 2005, 17 ( 2 : 165 - 170. 的濃度對于復(fù)合熒光定量 RT- PCR 的 CT 值有很大 影響 , 因此探針濃度的優(yōu)化非常必要。此外, P er s 9 so

5、n 等研究發(fā)現(xiàn) , T aq 酶的選擇至關(guān)重要 , 作者發(fā) 現(xiàn), H o tSt art T aq DNA 聚合酶比普通 T aq DNA 聚 合酶理想。當(dāng)然 , 該方法還有待完善, 雖然其污染概 率比常規(guī) RT- PCR 低, 但也可能出現(xiàn) , 因此 在操作 過程中, 要規(guī)范實驗操作 , 試劑要分裝使用, 盡量減 小污染機會。作者將在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上, 繼續(xù)對 其進行完善。 8 7 EGL I C, T HU R B, LIU L , et al. Q uant itativ e T aq M an RT - PCR fo r the det ection and differentiati

6、on o f Euro pean and N ort h A merican st rains of po rcine re pro ductive and r espir ator y sy ndro me virus J . J V ir ol M ethods , 2001, 98( 1 : 63 - 75. P AT ON D J, M CGO L DRICK A , G REISER - WIL K E I, et a l. Genetic ty ping classical sw ine fever virus J . V et Micr obiol , 2000, 73( 2 -

7、 3 : 137 - 157. 參考文獻 : 1 V A N RI JN P A , BO SSERS A , WEN SVCO RT G, et al. Classical sw ine fev er v irus ( CSF V envelope g ly co pr otein E2 containing o ne structural antig enic unit protects pig s fr om lethal CSFV challeng e J . J Gen Vir ol , 1996, 77( 11 : 2737 - 2745. 2 BRI NT ON M A, GOD

8、 EN Y E K , HO RZIN EK M C, et al. F amily A r ter iv irid ae M / / van REGEN M ORT EL M H V , F A U QU ET C M , BI SH O P D H L , et al. V ir us T ax onomy , Seventh Repo rt o f the In ternational Co mmittee o n T ax onomy of V ir uses, San Dieg o : Academic Pr ess, 2000: 851 - 857. 3 T O N G G Z ,

9、 ZHO U Y J, H A O X F , et al. H ighly pat ho genic por cine r epr oductive and respirato ry syn dr ome, China J . Emer g I nf ect D is , 2007, 13 ( 9 : 1434 - 1436. 12 11 10 9 P ER SSO N K, H AM BY K, U G OZZO L I L A . Fo ur co lo r multiplex rev er se tr anscr ipt ion po ly mer ase chain r eactio

10、n - Ov ercoming its limitat ions J . A nal B iochem , 2005, 344( 1 : 33 - 42. 涂長 春 . 豬 瘟國 際 流行 態(tài) 勢、 我國 現(xiàn) 狀及 防制 對 策 J . 中國 農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2003, 36( 8 : 955 -960. GIBSON U E, H EID C A , W ILL IA M S P M . A no vel method for real time quant itativ e RT - PCR J . Genome Res , 1996, 6( 10 : 995 - 1001. H IGU CH I R, FO CKL ER C,