沙門菌檢查法

1、沙門菌檢查法1簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊第一卷（1984）,沙門菌分5個(gè)亞屬。2003年出版的第八版的臨床微生物 手冊將沙門菌屬分成兩個(gè)菌種即腸炎沙門菌和乍得沙門菌，其中腸炎沙門菌分6個(gè)亞種，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙 型副傷寒、，鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌雜內(nèi)，迄今已發(fā)現(xiàn)2501個(gè)血清 型。O抗原抗血清A-E群包含了沙門菌分離株的95%所以常用沙門 菌A-F O多價(jià)血清進(jìn)行沙門菌初篩試驗(yàn)。藥品中的沙門菌，是以鑒定 沙門菌屬為準(zhǔn)，即對沒10g（或10ml）藥品中是否檢出沙門菌作出檢 驗(yàn)報(bào)告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學(xué)特性雖密切

2、相 關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵 蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的 影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、 生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等步驟。2儀器、設(shè)備及用具（見大腸埃希菌2）。3試液指示液（參見大腸埃希菌3）3.1無菌脲試液附錄2.5。3.2酚磺酞指示液附錄4.4。3.3亮綠試液附錄2.9。3.4氰化鉀試液附錄2.14。3.5溴甲酚紫指示液附錄4.5。3.6革蘭染色液附錄2.4,2.10,2.16。3.7沙門菌屬A-F“O多價(jià)

3、血清（即O多價(jià)1）生物制品研究所供應(yīng)。4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.2。4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基附錄5.1。4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基附錄5.3。4.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB 附錄5.8。4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC 附錄5.9。4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB 附錄5.11。4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）附錄5.10。4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL 附錄5.13。4.9沙門菌屬志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS 附錄5.12。4.10蛋白胨水培養(yǎng)基附錄5.18。4.11脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基附錄5.23。4.12氰化鉀培養(yǎng)基附錄5.24。4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基附錄5.25。5對照用

4、菌液取乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094是營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36C士1C培養(yǎng)1824h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106（濃度相當(dāng)于50100cfu/0.1ml）,作 陽性對照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計(jì)數(shù)法測得。即取0.1ml加入平皿內(nèi)，傾注營養(yǎng)瓊脂，混勻，或以0.1ml均勻涂布于事先準(zhǔn)備 好的營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)后點(diǎn)計(jì)求得。6操作方法6.1準(zhǔn)備工作：（見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)6）。6.2供試液的制備：（見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7）。含抑菌成分供試品供試液的制備：（見大腸埃希菌6.2）。6.3陽性對照實(shí)驗(yàn)、陰性對照實(shí)驗(yàn)（見大腸埃希菌7

5、.1）。6.4增菌培養(yǎng)6.4.1預(yù)增菌 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基2份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品使勻，另1份加入稀釋劑10ml作陰性對照，36C士1C培養(yǎng)1824h,觀察。搖動(dòng)陰性對照瓶后應(yīng)清亮透明，無 菌生長。6.4.2增菌培養(yǎng) 輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶，吸取1ml接種于1管 含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)1824h。6.5分離培養(yǎng) 輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培 養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂（DHL或沙門菌志賀菌瓊脂（SS平板及 曙紅亞甲藍(lán)（EMB瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)2448h。 檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)

6、特 征見表1表1沙門菌的菌落特征菌落形態(tài)黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（SS）無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色濕潤的圓形菌落中心有時(shí)為暗色由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色半 透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S,菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，HS特征有時(shí)不明顯，沙門 菌屬亞屬皿因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈 現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生HS,在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn) 黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙 門菌菌落形態(tài)， 須進(jìn)一步鑒別。 由于藥物的影響或非典

7、型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨 別。6.6初步鑒別試驗(yàn)從每個(gè)供試品的分離平板上挑取23個(gè)疑似菌落（菌落形態(tài)特征與 表1所列的形態(tài)特征相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種 時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位， 沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)1824h,觀膽鹽硫乳瓊脂（DHL無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶平板曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB無色至淺橙色，透明或半透明，光滑麥康凱瓊脂（MacC無色至淺橙色，透明或半透明，菌落察結(jié)果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為：斜面紅色（產(chǎn)堿）， 底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃

8、色（產(chǎn)酸）；斜面紅色，底層黃色； 斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生 氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。 對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無黑色， 或斜面及底層均為紅色 者可以排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗(yàn)， 血清凝集試驗(yàn)及革蘭染色，鏡檢。沙門菌應(yīng)為革蘭性桿菌。6.7生化試驗(yàn)6.7.1靛基質(zhì)試驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng) 基中，照大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰 性反應(yīng)。6.7.2脲酶試驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜 面，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。斜面變?yōu)?/p>

9、紅色為陽性反應(yīng)，沙門菌屬為陰 性反應(yīng)。6.7.3氰化鉀試驗(yàn) 竟培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2024h,用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán) 培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。對照管內(nèi)有菌生長（渾濁），而 試驗(yàn)管也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長（渾濁）而試驗(yàn)管無菌生長（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行， 防止氯化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低， 不能抑制細(xì)菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時(shí)須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基

10、, 每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20癟氧化鉀0.5ml，去毒，然后再滅菌，洗 滌。6.7.4賴氨酸脫羧酶試驗(yàn) 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸 脫羧酶培養(yǎng)基中， 同時(shí)接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照 管，培養(yǎng)2448h觀察結(jié)果。對照管黃色（產(chǎn)酸），試驗(yàn)管呈紫色為 陽性反應(yīng)（賴氨酸脫羧酶產(chǎn)堿）；試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng) 為陽性反應(yīng)。6.7.5動(dòng)力試驗(yàn)用接種針沾取培養(yǎng)物， 穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂 管中， 培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基 內(nèi)擴(kuò)散生長使培養(yǎng)基呈渾濁現(xiàn)象；無動(dòng)力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長， 不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室 溫保

11、留23天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動(dòng)力的變種 外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，動(dòng)力試驗(yàn)陽性。沙門菌生化反應(yīng)的初步鑒別見表2表2沙門菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗(yàn)的鑒別三糖鐵瓊脂斜面產(chǎn)層產(chǎn)氣硫化靛脲氰賴氨基酶化酸脫判定菌屬號氫質(zhì)鉀羧酶1.1+/+/+沙門菌屬1.2+/+沙門菌屬皿2+/+緩慢愛德華菌屬3+/+/+/+/+/弗勞地檸檬酸桿菌4.1一+S+一+一奇異變形桿菌4.2+/S+普通變形桿菌5+/+/+/+/大腸埃希桿菌6+/+志賀菌屬7.1+一一+/+一陰溝腸桿菌一7.2+/+肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌8+S/+/+普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬9+/+蜂房哈夫尼亞菌、粘質(zhì)沙雷菌注：

12、+產(chǎn)酸（黃色），陽性，陽性率90%產(chǎn)堿（紅色），陰性，陰 性率90%+/ 多數(shù)陽性、少數(shù)陰性；+S產(chǎn)生少量氣體（本表依 據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)參考第八版美國臨床微生物手冊）；反應(yīng)序號1.1不產(chǎn)HS可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗(yàn)，或加做部分生化試驗(yàn)， 判定為沙門菌；反應(yīng)序號1除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗(yàn)、賴氨 酸脫羧酶試驗(yàn)三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常；反應(yīng)序號2僅靛基質(zhì)陽性。其他情 況可排除沙門菌。6.8血清學(xué)凝集試驗(yàn)6.8.1準(zhǔn)備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接 種環(huán)沾取沙門菌屬O多價(jià)1血清23環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條 形涂抹， 長約1.5cm,寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法

13、 操作，作為陰性對照。682用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過濃。6.8.3將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下 進(jìn)行觀察，陰性對照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象都是陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時(shí)因血清效價(jià)低、反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿 內(nèi)，并放一個(gè)濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20mi n,再觀察結(jié)果。如果仍然沒有出現(xiàn)凝聚，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管 中，制成濃菌懸液，在100C水浴中保溫30min,以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集試驗(yàn)，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽性反應(yīng)；如 不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性

14、反應(yīng)。6.8.4如對照試驗(yàn)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對該菌株培養(yǎng)物進(jìn) 行處理后再作凝集試驗(yàn)。7結(jié)果判定7.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合 沙門菌屬反應(yīng)。多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陽性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100C30min處理后凝集試驗(yàn)為陽性反應(yīng)），報(bào)告10g或10ml供試品 檢出沙門菌。7.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)。多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100c30min處理 后凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)），報(bào)告10g或10ml供試品未檢出沙門菌。7.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況，應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種，送交有關(guān) 單位進(jìn)一不鑒定后，再作報(bào)告。73

15、1供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)符合沙門菌屬反應(yīng)多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陰性反應(yīng)。732供試品培養(yǎng)物的生化反應(yīng)不符合沙門菌屬反應(yīng)多價(jià)1血清凝集反應(yīng)呈陽性反應(yīng)。7.4對已檢出沙門菌的供試品分離的菌種， 有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌 型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性， 推斷可能菌型， 增加生化試驗(yàn)項(xiàng)目及沙 門菌單因子血清“O及“H進(jìn)行鑒定。8注意事項(xiàng)8.1試驗(yàn)用培養(yǎng)基，需經(jīng)過質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株（如乙型 副傷寒沙門菌CMCQB）50094進(jìn)行測試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng) 符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。分離平板 在使用 應(yīng)置36C溫箱內(nèi)倒置孵育12h,使其表面溫暖濕潤，利于 分離。8.2在對供試品

16、進(jìn)行測試的同時(shí)，需做陽性菌對照及陰性對照。陰性 對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性結(jié)果，否則檢驗(yàn)結(jié)果無效。特 別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時(shí)， 避免動(dòng)作過大，形成氣溶 膠，污染操作環(huán)境。8.3為保證試驗(yàn)方法發(fā)可靠性，對分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取 幾個(gè)菌落同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。挑取菌落時(shí)，不要在分離平板菌落密集部位 挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。8.4生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則， 不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗(yàn)陽性而生化試驗(yàn)不符合 時(shí)，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因?yàn)?污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)物重新分離，仔細(xì)選取 單個(gè)菌落再進(jìn)行試驗(yàn)。8.5所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗(yàn)要求進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂 斜面反應(yīng)的時(shí)間，應(yīng)在242h，時(shí)間過短過長，都可能出現(xiàn)錯(cuò)誤的 結(jié)果判斷。又如氰化鉀