實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)

1、實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;   (1)了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定原理和測(cè)定意義。    (2)學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。    (3)學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測(cè)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理    水的微生物學(xué)的檢驗(yàn)，特別是腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時(shí)也是評(píng)價(jià)水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國(guó)家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個(gè)，細(xì)菌總數(shù)每mL不超過100個(gè)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。&

2、#160;   所謂大腸菌群，是指在3724h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱。 水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，國(guó)際上已公認(rèn)大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對(duì)飲用水必須進(jìn)行大腸菌群的檢查。   水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)，但操作繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡(jiǎn)單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的

3、水樣。三、實(shí)驗(yàn)材料1、菌落總數(shù)的測(cè)定：1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水。2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。2、大腸菌群的測(cè)定：    1)培養(yǎng)基：    乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：    蛋白胨20g，膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。    制法：將蛋白胨、膽鹽、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL，并倒置放入一個(gè)杜氏小管，121

4、滅菌15min。    伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基：制法：將伊紅美藍(lán)瓊脂粉溶于水中，校正pH后分裝121滅菌15min備用。平板劃線法：接種是采用平板劃線的方法將初發(fā)酵的大腸桿菌進(jìn)行接種。四、實(shí)驗(yàn)方法1、水樣的采集：    1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。    2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋

5、好，再?gòu)乃腥〕?。如果不能?h內(nèi)檢測(cè)的，需放入冰箱中保存。2、細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：    1)水樣稀釋及培養(yǎng)：按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋；  根據(jù)對(duì)水樣污染情況的估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)重復(fù)。    將熔化后保溫度45的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁

6、熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。    待瓊脂凝固后，將平皿倒置于37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。    2)計(jì)算方法：    作平板計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 3)計(jì)數(shù)的報(bào)告：    選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落

7、生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。    細(xì)菌的菌落數(shù)在l00以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示。 3、大腸菌群的測(cè)定(多管發(fā)酵法)：    初步發(fā)酵試驗(yàn)：   在10支裝有10mL的乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中(內(nèi)有倒置小管)，以無菌操作各加入稀釋后的水樣1mL。搖勻后，37培養(yǎng)24h。    平板分離：    經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管(瓶)，分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板(EMB培養(yǎng)基)上，37培養(yǎng)1824h。大腸菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。  復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)： 將革蘭氏陰性無芽