病毒的分離鑒定

1、病毒的分離與鑒定要證明某種疾病是由某一感染性病毒所引起，則必須滿足以下原則： 從患病者體內(nèi)分離出病毒；在實驗動物或寄主細胞中可以培養(yǎng)； 證明這種培養(yǎng)物具有濾過性； 在原始宿主或相關(guān)種屬內(nèi)能產(chǎn)生同樣的病癥； 能重新分離出病毒。1. 病毒的分離1.1 標本的處理標本的收集a）糞便標本：將5g糞便標本和50ml PBS放入盛有20-25顆玻璃小珠 的100ml無菌瓶中，攪拌成懸液，倒出上清，3000xg, 4C離心 6min。b）拭子和生物體液：拭子浸在 2-3ml 運載培養(yǎng)基中，將棉拭子中的 液體盡量擠出以獲得標本，如果液體被污染，應(yīng)3000X g 4C離心 30min。c）組織標本：用無菌乳缽或

2、勻漿器研磨組織標本，同時加入足量的PBS制備成 20%的懸液，3000X g 4C離心 30min。除菌處理a）糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4C過夜。b）鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為 2000單位/毫升，置4C作用4小時c）對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，則可加入等量的乙醚 4C過夜除菌。1.2病毒的分離培養(yǎng)病毒是嚴格的細胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細胞。根據(jù) 病毒的不同選用敏感動物（動物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細 胞進行分離培養(yǎng)（細胞培養(yǎng)）。雞胚接種a）雞卵的選擇：一般都選新鮮、10天以內(nèi)的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量 上的一

3、致。b）孵育：孵育時可將雞卵放入卵箱內(nèi)進行，氣室向上，孵育的最適溫 度為38-39C，相對濕度為4070%，孵育8日后，雞卵應(yīng)每天 翻動12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。d）接種:c）檢卵：雞卵孵育45天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二 天一次）。未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影?；铍u 卵：雞胚發(fā)育4天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi) 有一小黑點（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動。死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵 血管模糊、擴張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，則可判斷胚 胎頻死或已經(jīng)死亡，應(yīng)將其挑撿出來。雞胚孵育完畢后，用鉛筆 劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。圖1.雞胚卵黃囊接種：用 58

4、 天雞胚，以細長針頭由雞卵氣室 圖朿2入卵黃囊膜腔接后取獲卵黃12 囊膜檢查胚,常«些嗜羊膜經(jīng)病 毒育分取羊水檢查。常用于流感 病毒的初次分離。半廣J世室處卵殼剝?nèi)ィú灰獙⑺槠淙霘つぃ﹫D3.尿囊腔接種用912天雞胚，將標本接種于尿囊腔，孵育后取尿囊液檢查，常用于培養(yǎng)流 感病毒和腮腺炎病毒等。圖4.絨毛尿囊膜接種：用10I 2 天雞胚，以無菌手續(xù)在蛋殼上開 小窗，然后將材料滴在絨毛尿 囊膜上孵育后。觀察膜上有無 斑點病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹 病毒、天花病毒和痘病毒。e）剖檢及收獲收獲前雞胚應(yīng)置4C冰箱過夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時，用碘酒將氣室部卵殼消毒，將氣。然后用無菌手術(shù)刀柄從胚

5、胎 背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素 小瓶內(nèi)，于低溫保存。f）優(yōu)缺點優(yōu)點：技術(shù)簡單、來源充沛、價格低廉、數(shù)量可大、不需特殊設(shè) 備。缺點：很多病毒不能適應(yīng)，主要是哺乳動物的病毒。細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)（cell culture）是指利用機械、酶或化學(xué)方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至24個細胞團懸液進行培養(yǎng)。根據(jù)細胞的 類型和培養(yǎng)細胞代數(shù)的不同，可將其分為兩種：原代細胞培養(yǎng)；傳代 細胞培養(yǎng)。組織細胞培養(yǎng)的病毒， 當出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變后， 就可取培養(yǎng)液 或培養(yǎng)液與細胞培養(yǎng)物混和物， 細胞培養(yǎng)物中的病毒可采用凍融、 超 聲波等方法使其釋放出來。 優(yōu)點：a) 每個細胞生理特性

6、基本一致，對病毒易感性相等；b) 無個體差異，準確性和重復(fù)性好；c) 可嚴格執(zhí)行無菌操作；d) 細胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長特征；e) 應(yīng)用空斑技術(shù)可進行病毒的克隆化。2. 病毒的鑒定2.1形態(tài)學(xué)鑒定細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE：病毒在細胞內(nèi)增殖后，可引起細胞的不同變化。常見的形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂毎麍A縮、聚合、溶解 或脫落。CPE出現(xiàn)的時間是鑒定病毒的標志之一。某些病毒感染細胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化， 在普通光學(xué)顯微鏡 下可見胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、 大小數(shù)量不等的 圓形或不規(guī)則形的團塊狀結(jié)構(gòu)，病毒學(xué)上稱為包涵體。 2.2血吸附和血凝作用多見于以出芽方

7、式釋放的病毒。 血吸附指感染細胞具有吸附紅細 胞的能力； 血凝作用指感染細胞的培養(yǎng)液中有許多游離病毒存在， 具 有凝集紅細胞的作用。2.2.1 血吸附實驗具有血凝能力的病毒能使感染的細胞吸附紅細胞， 這種現(xiàn)象被稱作吸 附作用。大多數(shù)粘液病毒能引起吸附。具體檢驗步驟如下：a）用PBS配制10%的豚鼠紅細胞懸液，4C保存，用前按需要量稀釋 成的濃度（10%懸液1ml加19ml PBS昆勻）。b）吸去對照和試驗管培養(yǎng)細胞的上清液，試驗管的上清液留待電鏡 觀察。c）每管加入紅細胞懸液，4C孵育30min。用4C的PBS清洗培養(yǎng)細 胞3次。d）顯微鏡下讀取結(jié)果并記錄，根據(jù)吸附紅細胞的量可分為 0（陰性）

8、 4（完全吸附）級。e）37C孵育60min,有神經(jīng)氨酸酶的病毒將會從紅細胞上游離下來。2.2.2 血凝實驗a）在血凝板第一排的112孔加入50卩I生理鹽水。b）在第1孔中加入50卩I病毒，混勻后吸50卩I到第2孑L,如此倍比 稀釋直到第10孔，混勻后棄50卩I;最后兩孔（11、12）為紅細 胞對照。c）將1%的紅細胞輕輕搖動混勻，在112孔中每孔加入50卩I。d）手工震蕩，37C靜置30min （室溫40min）后觀察結(jié)果。2.3電子顯微鏡檢查病毒的很多特征如大小、 形態(tài)、結(jié)構(gòu)等必須借助電子顯微鏡進行 檢查。對于目前尚難培養(yǎng)而形態(tài)又非常典型的病毒， 可直接從感染組 織或分泌液，或者接種病料的

9、雞胚和細胞培養(yǎng)收獲的材料作電子顯微 鏡檢查，直接觀察病毒粒子。2.3.1 正染法：超薄切片法取材T固定(戊二醛/四氧化鋨)7清洗與脫水T浸透、包埋與聚合T切片T染色(鈾染/鉛染)a) 優(yōu)點：可觀察病毒形態(tài)和形態(tài)發(fā)生過程。b) 缺點：操作復(fù)雜，費時，但標本可長時間保存。2.3.2 負染技術(shù) 負染是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電 子密度，使樣品顯示負的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。具體步驟 (漂浮法)為： 現(xiàn)將需負染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有 支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品， 用濾紙吸干樣品余液使 樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜， 在樣品未干時即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng) 上，用濾紙吸干多余的染液即可。a) 優(yōu)點：快速簡易( 10-20min ) ；分辨率高；圖象清晰地病毒結(jié)構(gòu)。b) 缺點：敏感性低，要求病毒量在 107 以上；所有樣品應(yīng)處于懸浮 狀態(tài)。2.4血清學(xué)試驗可采用ELISA瓊脂擴散、中和試驗、標記抗體技術(shù)等免疫血清學(xué)方法檢查病畜的抗體消長情況和發(fā)病組織中的病毒抗原。2.4.1 中和反應(yīng) 利用病毒與特異性中和抗體結(jié)合的特性鑒定病毒的種類， 觀察特異性抗體能否保護易感的試驗動物死亡， 能否抑制病毒的細胞病變效 應(yīng)。2.4.2