淺論VEGF單克隆抗體對胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響

1、淺論VEGF單克隆抗體對胰腺缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡的影響                  作者：楊家紅 謝嶸 王瑩 范昕【摘要】  目的： 從胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的角度探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單克隆抗體在胰腺缺血再灌注損傷中保護(hù)作用。方法： 采用鉗閉大鼠腹腔干、腸系膜上動脈制備胰腺缺血再灌注損傷模型，并應(yīng)用細(xì)胞凋亡原位標(biāo)記法(TUNEL)、免疫組化技術(shù)等檢測VEGF單克隆抗體干預(yù)后對胰腺細(xì)胞凋亡及Bax,Bcl2蛋白表

2、達(dá)的影響。結(jié)果： 干預(yù)組15，30，60 min胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組(P0.01)。正常胰腺組織未見凋亡調(diào)控基因Bcl2的表達(dá), VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bcl2染色陽性率明顯高于缺血再灌注組(P0.01)；正常胰腺組織見較弱的凋亡調(diào)控基因Bax的表達(dá)，而VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bax染色陽性率明顯低于缺血再灌注組(P0.01)。結(jié)論： VEGF單克隆抗體能夠通過抑制胰腺腺泡細(xì)胞的過度凋亡減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度，該作用可能是通過促進(jìn)抗凋亡Bcl2基因表達(dá)，抑制促進(jìn)凋亡基因Bax表達(dá)來實現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】 

3、胰腺； 缺血再灌注； 細(xì)胞凋亡； VEGF單克隆抗體； Bax； Bcl2   Abstract  Objective: To investigate the effect of VEGF McAb  protecting on pancreas injury during experimental ischemic/reperfusion in rats.Methods： Ischemic/reperfusion models were made by ligated both the anterior menseneric artery and th

4、e celica artery of 70 rats.Apoptosis of pancreatic acinar cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPbiot in nick end labeling(TUNEL) method, and the expression of apoptosis regulated gene Bax and Bcl2 was detected by immunohistochemical technique. Results： The index of

5、 apoptosis increased significantly in pancreatic tissues after pancreatic ischemia/reperfusion injury but  offset by administration of VEGF McAb.Immunohistochemical analysis showed that just weak Bax staining cells were detected, with no Bcl2 positive staining cells in normal pancreatic tissues

6、.The positive rate of Bcl2 protein in VEGF McAb group was significantly higher than ischemic/reperfusion group while the positive rate of Bax was significantly lower(all P0.01). Conclusion： VEGF McAb treatment alleviated pancreatic ischemia/reperfusion injury by restraining excessive apoptosis.This

7、effect might be related with upregulating the expression of Bcl2 and downregulating the expression of Bax.   Key words  pancrease;   ischemic/reperfusion;   apoptosis;   VEGF McAb;   Bax;   Bcl2   缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I

8、/R)損傷是一種常見的臨床病理生理過程，在急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系1，現(xiàn)已證實，AP大鼠的發(fā)病過程中胰腺存在細(xì)胞凋亡的改變，且與其病變的嚴(yán)重程度有關(guān)2。本實驗旨在探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)單克隆抗體在I/R損傷后對胰腺細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制，以探討AP治療的新途徑。   1  材料與方法   1.1  動物及主要試劑   清潔級SD大鼠共70只，雌雄不限（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），VEGF單克隆抗體（Santa Cruz 公司

9、），鼠抗Bcl2單克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司）、兔抗Bax單克隆抗體（Santa Cruz公司），鏈霉素親生物素過氧化物酶標(biāo)(SP)免疫組化試劑盒(Biotech公司產(chǎn)品)。   1.2  方  法   1.3  胰腺組織的檢測   1.4  統(tǒng)計學(xué)處理   用SPSS11.5統(tǒng)計軟件行方差齊性檢驗、方差分析、t檢驗和t檢驗， P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。          &

10、#160; 2  結(jié)  果   2.1  胰腺細(xì)胞的凋亡情況   對照組中有少量腺泡細(xì)胞的凋亡，且組內(nèi)各時間點凋亡指數(shù)相當(dāng)。缺血再灌注組及VEGF單抗干預(yù)組的凋亡指數(shù)隨著缺血時間的延長，逐漸加重，均明顯高于對照組(P0.01)。VEGF單抗干預(yù)組凋亡指數(shù)均明顯低于同時間點缺血再灌注組(P0.01)。見表1。   2.2  胰腺腺泡細(xì)胞Bax 表達(dá)的變化   正常胰腺組織見較弱的凋亡調(diào)控基因Bax的表達(dá)，而VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bax 染色陽性

11、率明顯低于缺血再灌注組（P0.01）。見表2。表1  各組凋亡指數(shù)的比較表2  各組凋亡調(diào)控基因Bax,Bcl2 染色陽性率比較a:與缺血再灌注組同時間點比較, P0.01   正常胰腺組織未見有Bcl2 表達(dá)，VEGF單克隆抗體干預(yù)后15，30，60 min胰腺細(xì)胞Bcl2染色陽性率明顯高于缺血再灌注組(P0.01)。   3  討  論   目前認(rèn)為， I/R 是胰腺炎、尤其是胰腺移植后胰腺炎的重要原因3，而VEGF可能是其加重因素。其原因可能為VEGF參與了在I/R中白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互

12、作用；同時有研究表明VEGF本身能增加血管通透性增加，降低功能性血管密度，加重缺血損傷4。再灌注期，浸潤的炎癥細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)與氧自由基、細(xì)胞因子等相互作用、互為因果，形成瀑布樣效應(yīng)，造成微循環(huán)紊亂，從而使胰腺損傷進(jìn)一步加劇5。應(yīng)用VEGF單克隆抗體后，能夠減輕起始階段的炎癥因子與白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減輕瀑布樣反應(yīng)。   目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡由兩條通路調(diào)節(jié)：細(xì)胞表面死亡受體通路和線粒體通路，這兩條通路都參與了胰腺缺血再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡，比較受重視的是凋亡發(fā)生的線粒體途徑。在線粒體途徑中，Bcl2家族蛋白在其中起重要作用。本研究選擇的兩個基因Bax 和Bcl2是凋

13、亡調(diào)控基因Bcl2家族成員之一，Bax可形成同源二聚體BaxBax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;而當(dāng)Bcl2存在時，Bcl2可以與Bax形成比BaxBax二聚體更穩(wěn)定的BaxBcl2異源二聚體，從而中和BaxBax二聚體的促凋亡作用。因此Bcl2/Bax的比例可決定細(xì)胞的命運，其比例增高，細(xì)胞不易發(fā)生凋亡，比例降低則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax過度表達(dá)時可抑制Bcl2功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡6，Bcl2，Bax二者作用相互拮抗7。在我們早期研究中發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1受體拮抗劑可以通過調(diào)節(jié)Bcl2，Bax表達(dá)胰減輕腺炎的嚴(yán)重程度8。本實驗顯示在正常胰腺組織未見凋亡調(diào)控基因Bcl2表達(dá)而Bax弱表達(dá)。VEGF單抗干預(yù)組及

14、缺血再灌注組15，30，60 min的胰腺細(xì)胞Bax染色陽性率高于對照組，VEGF單抗干預(yù)組Bax染色陽性率明顯低于缺血再灌注組相應(yīng)時間點；VEGF單抗干預(yù)組胰腺細(xì)胞Bcl2 染色陽性率明顯高于缺血再灌注組15，30，60 min染色陽性率(P均0.01)。   在胰腺缺血再灌注損傷早期便可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，這可能是胰腺缺血再灌注損傷早期的主要表現(xiàn)。過多的細(xì)胞凋亡超過組織自身的清除能力，凋亡的細(xì)胞會向壞死轉(zhuǎn)化，反而會加重再灌注后的炎癥反應(yīng)，故胰腺出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞不利于胰腺功能的恢復(fù)。通過實驗我們推測VEGF單克隆抗體可能通過上調(diào)抑制凋亡基因Bcl2的表達(dá)，抑制促凋亡基因Bax

15、表達(dá)來抑制缺血再灌注過程的細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)胰腺細(xì)胞?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Fujimoto K, Hosotani R, Wada M, et al.Ischemiareperfusion injury on the pancreas in rats: identification of acinar cell apoptosisJ.J Surg Res, 1997，71(2):127-136.2 常 華, 嚴(yán)際慎, 羅建飛, 等.大鼠急性胰腺炎胰腺細(xì)胞凋亡改變的實驗研究J.肝膽胰外科雜志, 2001，13(3):147-148.3 Fan H, Sun B, Gu Q, et al

16、.Oxygen radicals trigger activation of NFkappaB and AP1 and upregulation of ICAM 1 in reperfused canine heartJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002, 282(5):H1778-H1786.4 von Dobschuetz E，Meyer S，Thorn D， et al.Targeting vascular endothelial growth factor pathway offers new possibilities to countera

17、ct microvascular disturbances during ischemia/reperfusion of the pancreaJ.Transplantation，2006，82(4)：543-549.5 Toda K, Kayano K, Karimova A, et al.Antisense intercellular adhesion molecule1(ICAM1) oligodeoxyribonucleotide delivered during organ preservation inhibits posttransplant ICAM1 expression and reduces primary lung isograft failureJ.Circ Res,2000, 86(2): 166-174.6 Oltvai ZN,Milliman CL, Korsemeyer SJ.Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved hemology, bax, that accelerates programmed