用免疫熒光方法檢測(cè)鼻咽分泌物中多種呼吸道病毒抗原

1、    用免疫熒光方法檢測(cè)鼻咽 分泌物中多種呼吸道病毒抗原        【摘要】目的評(píng)價(jià)一種商品化的免疫熒光檢測(cè)試劑 (Chemicon International Inc, Temecula, CA, USA)用于呼吸道病毒感染診斷的敏感性及特異性。方法間接免疫熒光方法，包括篩查及確定試驗(yàn)。篩查試劑中含有7種混合單克隆抗體，即甲型及乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV)、副流感病毒1、2、3型及腺病毒單克隆抗體。此外還有分別針對(duì)上述7種病毒的單克隆抗體用于確定試

2、驗(yàn)。本研究用Chemicon 試劑盒對(duì)96例患兒的凍存鼻咽分泌物或支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片標(biāo)本進(jìn)行回顧性檢測(cè)，并與病毒分離結(jié)果進(jìn)行比較。此外還用Chemicon 試劑檢測(cè)了1994年11月1995年2月北京兒童醫(yī)院300例下呼吸道感染患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本。結(jié)果與病毒分離結(jié)果相比，Chemicon確定試劑檢測(cè)病毒抗原的敏感性為95%、特異性為86%。北京兒童醫(yī)院的標(biāo)本中有38%(105/280)被確定為病毒感染，其中甲型流感病毒20%、RSV 14%、腺病毒3%、副流感病毒1、2、及3型7%。結(jié)論Chemicon呼吸道病毒診斷試劑能夠同時(shí)檢測(cè)多種呼吸道病毒抗原，對(duì)于確定呼吸道病毒感染是一種非常好

3、的方法。但需要注意的是在篩查試驗(yàn)中有4%8% 的標(biāo)本呈非特異染色。【關(guān)鍵詞】熒光免疫測(cè)定呼吸道合胞病毒抗體，單克隆抗原，病毒 Detection of multiple respiratory viral antigens in nasopharyngeal secretions with immunofluorescence assay SHEN Kunling*, MAI Ying, LIU Yayi, et al.*Department of Pediatric Internal Medicine, Beijing Childrens Hospital, Beijing 100045【A

4、bstract】ObjectiveAntigen detection with immunofluorescence is an efficient method for diagnosis of respiratory tract infections, but such a method previously has not been applied for simple screening of multiple respiratory viruses. Pools of monoclonal antibodies against various respiratory viruses

5、are now available, and are proven to be potentially important tools for improvement of antigen detection in nasopharyngeal secretion specimen. To evaluate the commercially available Chemicon immunofluorescence assay (IFA, respiratory viruses panel and identification kit), an indirect IFA containing

6、a pool of monoclonal antibodies for screening for influenza virus types A and B, respiratory syncytial virus (RSV), parainfluenza virus types 1,2 and 3 and adenovirus, and the respective individual monoclonal ntibodies.MethodsFrozen nasopharyngeal secretions or bronchoalveolar lavage specimens from

7、96 patients with respiratory infections were retrospectively examined with the assay, and the results were compared with cell culture virus isolation. Nasopharyngeal secretions from 300 children with lower respiratory tract infections collected at Beijing Childrens Hospital during the 1994-1995 wint

8、er season were also examined with the IFA.ResultsThe sensitivity of the Chemicon assay versus virus isolation was 95% and specificity 86%. A viral etiology was identified in 105/280 (38%) Chinese children whose samples were evaluable (influenza A 20%, RSV 14%, adenovirus 3% and parainfluenza 1,2,3,7

9、%).ConclusionThe Chemicon IFA was shown to be an excellent tool for identification of viral respiratory tract infections although there was a problem with the the screening assay where around 4%-8% of samples had non-specific staining, necessitating verification test.【Key words】FluoroimmunoassayResp

10、iratory syncytial virusesAntibodies, monoclonalAntigens, viral呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、副流感病毒1、2及3型和腺病毒是下呼吸道感染的常見病原1-3?？焖僭\斷呼吸道病毒感染對(duì)于指導(dǎo)治療、避免不必要的抗生素使用及采取必要的隔離措施都有重要意義4。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的病毒抗原已有20多年歷史，是快速、有效而廉價(jià)的方法5，6。雖然病毒分離仍為“黃金”方法，但由于不同病毒需要不同的培養(yǎng)細(xì)胞很難在普通試驗(yàn)室作為常規(guī)使用7。聚合酶鏈反應(yīng)可能比免疫熒光方法更為敏感，但價(jià)格貴，對(duì)RNA病毒需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Chemicon呼吸道病毒

11、診斷試劑可以同時(shí)在一孔細(xì)胞涂片上進(jìn)行7種病毒抗原篩查。如篩查為陽性則再用單一病毒特異的單克隆抗體進(jìn)行確定試驗(yàn)?？蓽p少對(duì)陰性標(biāo)本的不必要的單一病毒抗原的檢測(cè)，同時(shí)又不致遺漏常見的呼吸道病毒。材料與方法一、臨床標(biāo)本1.標(biāo)本采集時(shí)間為1995年2月14日1995年3月6日，急性下呼吸道感染患兒82例的鼻咽分泌物及14例支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片，標(biāo)本取自瑞典Karolinska醫(yī)院病毒室。2.北京兒童醫(yī)院的300例急性下呼吸道感染患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本。其中83例為門診患兒，217例為住院患兒，年齡為2個(gè)月14歲，標(biāo)本采集時(shí)間為1994年11月1995年2月。二、標(biāo)本采集將塑料導(dǎo)管經(jīng)鼻腔插入78 cm，

12、達(dá)到咽部后輕輕吸取鼻咽分泌物，然后用2 ml消毒生理鹽水沖管，標(biāo)本立即送實(shí)驗(yàn)室。三、細(xì)胞涂片制備用吸管吹打粘液后，1 000 r/min離心10分鐘，上清液用于病毒分離，沉淀物用10 ml PBS洗滌，再用少量PBS懸浮，然后點(diǎn)于多孔涂片上，每片涂612孔，空氣干燥后用冷丙酮固定10分鐘，-20保存。四、病毒分離分離流感病毒、副流感病毒及呼吸道合胞病毒(RSV)，使用馬丁-達(dá)比狗腎(MDCK)及Ma-104細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，總時(shí)間為3周。對(duì)7天未見細(xì)胞病變的MDCK細(xì)胞及14天未見病變的Ma-104細(xì)胞進(jìn)行血液吸附試驗(yàn)。對(duì)有細(xì)胞病變或血液吸附試驗(yàn)陽性的標(biāo)本再通過直接免疫熒光方法鑒定。五、Chemi

13、con免疫熒光檢測(cè)用Chemicon試劑(Chemicon International Inc, Temecula, CA, USA)對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。篩查試劑中含有7種混合單克隆抗體，即甲型及乙型流感病毒、RSV、副流感病毒1、2、3型及腺病毒單克隆抗體。當(dāng)篩查試驗(yàn)為陽性時(shí)，再用單一特異性單克隆抗體對(duì)新鮮標(biāo)本孔進(jìn)行檢測(cè)。1020 l混合單克隆抗體或單一單克隆抗體置于標(biāo)本上，在37孵育30分鐘后，用PBS洗片3次，加含伊文斯藍(lán)的熒光素標(biāo)記羊抗鼠IgG, 37孵育30分鐘，風(fēng)干后封片。在熒光顯微鏡下讀片，放大倍數(shù)為400倍。由試劑盒提供陽性及陰性對(duì)照。如果一孔涂片中含有大約200個(gè)

14、細(xì)胞，則認(rèn)為此片是可以評(píng)價(jià)的。在篩查試驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)有2個(gè)完整的明顯的細(xì)胞內(nèi)染色，則認(rèn)為篩查陽性。在確定試驗(yàn)中RSV及副流感病毒顯示細(xì)胞漿內(nèi)包涵體，甲型及乙型流感病毒為核染色或細(xì)胞漿染色。對(duì)第一部分標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行篩查及7種病毒的確定。在第二部分標(biāo)本中，一張涂片用于篩查，如篩查為陽性，則用另一張涂片進(jìn)行確定試驗(yàn)。第一部分標(biāo)本由3人分別閱片，第二部分標(biāo)本由2人分別閱片。六、數(shù)據(jù)處理將Chemicon篩查及確定試驗(yàn)中均為陽性且在病毒分離中亦為陽性的標(biāo)本定為真陽性(TP)，Chemicon篩查陰性而病毒分離為陽性的標(biāo)本定為假陰性(FN)。在Chemicon篩查及確定試驗(yàn)中均為陽性而病毒分離為陰性的標(biāo)本為假

15、陽性（FP）。篩查為陽性的標(biāo)本如被確定試驗(yàn)證實(shí)為陰性，則被認(rèn)為是非特異染色。經(jīng)所有方法檢查均為陰性的標(biāo)本被認(rèn)為是真陰性（TF）8。七、計(jì)算公式敏感性()=TP/(TP+FN)×100%; 特異性(%)=TN/(TN+FP)×100%結(jié)果一、第一部分標(biāo)本結(jié)果用Chemicon試劑篩查與確定試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行，以避免重復(fù)染色對(duì)標(biāo)本的破壞。96例患兒的標(biāo)本中有8例的細(xì)胞數(shù)太少，因此有88例患兒的標(biāo)本可用于評(píng)價(jià)，見表1。22例病毒分離陽性(25%)。用Chemicon試劑篩查檢出了22例病毒分離陽性者中的96%的病例(21/22)。38例篩查陽性的標(biāo)本中有31例在確定試驗(yàn)中顯示特異染色8

16、2%(31/38)。1例篩查試驗(yàn)陽性而確定試驗(yàn)陰性的標(biāo)本，病毒分離顯示為乙型流感病毒，還有另外6例，共7例（7/88, 8%)確定試驗(yàn)陰性或呈現(xiàn)非特異染色。與病毒分離比較，Chemicon確定試驗(yàn)的敏感性為95%,特異性為86% 。由Chemicon篩查及確定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的另5例RSV，3位閱片人均認(rèn)為其染色為特異性染色。表1Chemicon檢測(cè)與病毒分離的特異性及敏感性陽性標(biāo)本Chemicon確定陽性病毒分離陽性真陽性假陽性假陰性特異性(%)敏感性(%)總陽性3122201128695RSV2112111018891副流感病毒33333100100甲型流感病毒2111098100乙型流感病毒23

17、20110066腺病毒3221098100注：表中數(shù)字除最后兩列外均為例數(shù)二、第二部分標(biāo)本結(jié)果由北京兒童醫(yī)院收集的300例患兒的細(xì)胞涂片標(biāo)本中，280例有足夠的細(xì)胞。Chemicon篩查及確定試驗(yàn)證實(shí)105例(38%)的標(biāo)本含有病毒抗原。其中甲型流感病毒抗原陽性50例，RSV陽性36例，腺病毒陽性9例，副流感病毒2型陽性5例，3型陽性3例，1及3型同時(shí)感染2例。Chemicon篩查試驗(yàn)中，4%(12/280)為非特異染色。討論Chemicon方法已被報(bào)道過，并經(jīng)過WHO的3個(gè)參考中心審評(píng)，結(jié)果良好9。在本研究中，Chemicon篩查及確定試驗(yàn)對(duì)凍存標(biāo)本的回顧性檢測(cè)表明本方法的特異性86 ，敏感

18、性達(dá)95。而Chemicon方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以一次篩查多種病毒抗原。在7種呼吸道病毒中，用Chemicon試驗(yàn)檢測(cè)RSV的陽性率(21/88,25%)高于病毒分離(12/88, 13%)，有研究表明免疫熒光法較細(xì)胞培養(yǎng)確定RSV感染更為有效10，11。由于19941995年瑞典沒有出現(xiàn)許多流感病例，因此，尚不能充分地評(píng)價(jià)Chemicon檢測(cè)流感病毒的效果。在19941995年流感流行季節(jié)，北京兒童下呼吸道感染者中有19被證實(shí)為甲型流感病毒感染，這也說明此方法的高度敏感性。免疫熒光法診斷呼吸道病毒感染的快速及實(shí)用性已被許多研究證實(shí)。利用混合單克隆抗體進(jìn)行篩查是一個(gè)很大的進(jìn)展12-14。本方法的

19、缺點(diǎn)是在篩查中有4%8% 的標(biāo)本為非特異染色，有時(shí)這種非特異染色非常明顯，可分布于細(xì)胞核周圍，杯狀細(xì)胞上部或?yàn)榧?xì)胞內(nèi)散在的包涵體，閱片人的經(jīng)驗(yàn)對(duì)于區(qū)別特異與非特異性染色是非常重要的。在臨床工作中不能僅根據(jù)篩查結(jié)果作出診斷，對(duì)篩查陽性者必須進(jìn)行確定試驗(yàn)。此外，也應(yīng)特別注意操作方法。最好是分別使用2張細(xì)胞涂片進(jìn)行篩查與確定試驗(yàn)，以免重新染色時(shí)丟失細(xì)胞和破壞抗原表達(dá)?？着c孔之間要有比較明顯的分界，以免試劑之間的污染。在標(biāo)本被送到實(shí)驗(yàn)室后2小時(shí)內(nèi)可以進(jìn)行7種呼吸道病毒的檢測(cè)是本試劑的最大優(yōu)點(diǎn)。在當(dāng)今濫用抗生素，大量抗生素耐藥菌株出現(xiàn)的情況下，迅速、正確的病毒病因診斷是非常重要的。本研究發(fā)現(xiàn)在北京下呼吸

20、道感染兒童中38%為病毒感染所致，也提示快速診斷的重要性。作者單位：100045首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市兒童醫(yī)院內(nèi)科（申昆玲）;北京市兒科研究所（買穎、劉亞誼、江載芳）; 中國醫(yī)學(xué)論壇報(bào)社（照日格）; Department of Virology, Swedish Institute for Infectious Disease Control, S-105 21 Stockholm, Sweden（Annika Linde）參考文獻(xiàn)1Palumbo PE, Douglas Jr. Respiratory tract infections. In: Spector S, Lancz GJ. ed

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