欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對(duì)Hca-F肝癌的作用

1、    欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對(duì)Hca-F肝癌的作用作者:郭連英，陳 駿，沈 潔，邢 嶸1，施廣霞，錢振超【摘要】 目的 本實(shí)驗(yàn)采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制/干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對(duì)欖香烯抗瘤作用的 影響 ，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。 方法 將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯（50g/ml）、吡柔比星（THP）（10mol/ml）、單獨(dú)和復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞（不處理）為陰性對(duì)照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)

2、觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法 計(jì)算 細(xì)胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯(lián)合處理對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果 欖香烯聯(lián)合吡柔比星處理Hca-F比單獨(dú)使用兩種藥物的抑瘤率都高。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對(duì)新的蛋白質(zhì)表達(dá)依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)（如酶）等而直接殺傷腫瘤靶細(xì)胞，使對(duì)欖香烯抗瘤作用靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)又進(jìn)了一步。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強(qiáng)，這對(duì)欖香烯聯(lián)合其他藥物 治療 腫瘤可能有一定 參考 意

3、義。【關(guān)鍵詞】 欖香烯；抑制劑；肝細(xì)胞癌  The  effect of elemene combined with inhibitors of macromolecular synthesis for hepatic cancer【Abstract】 Objective In this experiment of Hca-F cells (a murine hepatic cell carcinoma) were treated with elemene combined with inhibitors of macromolecular synthe

4、sis， their proliferation， survival， cell cycle， apoptosis and morphology were observed. To clarify the influences of inhibition of DNA， RNA and protein on the antitumor effects of elemene and to find the possible target site of elemene.Methods The Hca-F cells were singled or mingled treated with ele

5、mene（50g/ml），alone or combined with THP （10mol/ml）， the Hca-F cells(without treatment) were used to be the negative compare. The end consistence of Hca-F cells is 1×106/ml， three tubles in every time point. To calculate the proportion of survival with trypanblue， and observe the impact on the u

6、ltrastructure of Hca-F cells treated with elemene and THP in transmission electron microscope， and examine the apoptosis and cell cycles in flow cytometer. Results The inhibition rate of proliferation of Hca-F treated with elemene and THP was higher than that of Hca-F treated with elemene only.Concl

7、usion These results showed that the antitumor effects of elemene could not abolished by combined treatment or pretreatment with the inhibitors of DNA， RNA， protein synthesis，  which  suggest that the antitumor effects of elemene may be independent on their synthesis. Combined usa

8、ge of elemene with THP to cancer therapy is advisable. 【Key words】 elemene；inhibitor；hepatocellular carcinoma欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術(shù)（經(jīng)鑒定為我國(guó)特有新種定名為溫郁金，Curcuma Wenyujin）揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳?xì)?C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物， 此類物質(zhì)有抗癌活性屬我國(guó)首報(bào)1。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床 應(yīng)用 均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應(yīng)很低。我們過(guò)去的 研究 表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其

9、凋亡外，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，欖香烯處理能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞膜HSP70的表達(dá)，用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)的研究表明欖香烯處理引起基因表達(dá)譜的變化。過(guò)去對(duì)欖香烯抗癌作用機(jī)制的研究?jī)H限于欖香烯對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于它的作用靶點(diǎn)及其信號(hào)傳導(dǎo)通路迄今研究很少。本實(shí)驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制或干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對(duì)欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。1 材料與方法11 動(dòng)物 Balb/c系小鼠，引自 中國(guó) 醫(yī)學(xué) 科學(xué) 院北京

10、藥物研究所，由本室自行繁殖提供。12 瘤株 小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系Hca-F2，由本校病 理學(xué) 教研室凌茂英教授贈(zèng)送，本室常規(guī)傳代、保種。1.3 主要藥品和試劑 1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所 )。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO，USA）。1.4 Hca-F細(xì)胞懸液的制備 將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細(xì)胞常規(guī)接種于小鼠腹腔，0.2ml/只，收集第78天的腹水（腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛時(shí)期，死亡細(xì)胞和紅細(xì)胞含量較少），HS液破除紅細(xì)胞，PBS 洗3次，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，用含20%小牛血清RP

11、MI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至所需濃度。1.5 Hca-F肝癌細(xì)胞的處理 將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯（50g/ml）、吡柔比星（10mol/ml）按本室常規(guī)方法單獨(dú)或復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞（不處理）對(duì)照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，加入相應(yīng)的藥品，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法于不同時(shí)間計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活率。1.6 單純欖香烯處理和欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)Hca-F增殖的影響 用MTT法測(cè)其OD值。1.7 欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響3 Hca-F細(xì)胞用欖香烯、THP單一或復(fù)合處理，細(xì)胞濃度和處理方法同前，處理時(shí)間為1h，收細(xì)胞，用PBS洗3次

12、，以2.5%戊二醛固定，常規(guī)包埋制片，鈾鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。1.8 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)和細(xì)胞周期的測(cè)定 細(xì)胞收集同前，用PBS洗3次，加入 PI染色液染色30min（避光、室溫）。上機(jī)檢測(cè)，Cellquest軟件低速獲取。用Modfit2.0軟件 分析 。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)Hca-F存活的影響 單純用欖香烯處理，Hca-F的存活率就明顯降低，在30min1h的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞死亡率隨著藥物濃度增加而增加（表1），單用THP處理，也可導(dǎo)致Hca-F細(xì)胞死亡、藍(lán)染，其細(xì)胞死亡率也隨著藥物濃度增加而增加，欖香烯聯(lián)合THP處理，腫瘤細(xì)胞死亡率可達(dá)100%。表1 欖香烯單獨(dú)或聯(lián)

13、合THP處理對(duì)Hca-F細(xì)胞存活的影2.2 欖香烯和THP聯(lián)合處理對(duì)Hca-F細(xì)胞周期與凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯與THP聯(lián)合處理對(duì)Hca-F細(xì)胞周期變化的影響及凋亡細(xì)胞百分率變化與單用THP相比也無(wú)明顯區(qū)別， 欖香烯處理與不處理Hca-F對(duì)照組細(xì)胞各時(shí)相百分率及凋亡細(xì)胞百分率變化無(wú)明顯區(qū)別（見(jiàn)表2和圖1）。表2 欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)Hca-F細(xì)胞周期與凋亡的 影響 2.3 欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)Hca-F細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 見(jiàn)圖2。圖2可示：當(dāng)欖香烯與THP聯(lián)合處理的腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，核縮小，細(xì)胞腫脹破裂，細(xì)胞完整性受到明顯破壞，而單純用THP處理的30mi

14、n內(nèi)大多數(shù)沒(méi)有明顯改變，受損細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化不典型，偶可見(jiàn)到凋亡、壞死的細(xì)胞，但比率并不高。圖1 A： 對(duì)照組；B： 欖香烯50g/ml；C： THP 10mol/ml；D： 欖香烯50g/ml聯(lián)合THP10mol/ml對(duì)Hca-F細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞儀 分析 結(jié)果圖1 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果A：THP 10mol/ml；B：欖香烯50g/ml聯(lián)合THP10mol/ml；C： 對(duì)照組；D： 欖香烯50g/ml圖2 欖香烯聯(lián)合THP處理對(duì)后Hca-F細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變3 討論大連醫(yī)科大學(xué)病理生 理學(xué) 教研室和腫瘤生物 治療  研究 所從20世紀(jì)70年代起就開(kāi)展了莪術(shù)油、欖香烯抗癌作

15、用的機(jī)理研究35。結(jié)果表明欖香烯處理能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。為了闡明后者與欖香烯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞膜熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）表達(dá)之間的關(guān)系7，我們采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、免疫組化、RTPCR以及基因芯片等技術(shù)進(jìn)行了較深入的研究，結(jié)果表明，欖香烯處理能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞膜HSP70的表達(dá)，但不增強(qiáng)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄，提示這僅僅涉及HSP分布的改變。為較準(zhǔn)確展現(xiàn)可能與欖香烯抗癌作用有直接關(guān)系的基因表達(dá)變化，我們用欖香烯（濃度為50g /ml，作用時(shí)間1h） 處理人肝癌細(xì)胞HepG2，用表達(dá)譜基因芯片（Affymetrix， Human Genom

16、e， U95A Part#， 510448， Lot# 9913250-9913251，U.S.A.，其上有12550條寡聚核苷酸）技術(shù)研究了欖香烯處理引起基因表達(dá)譜的變化并與未經(jīng)欖香烯處理的和熱休克的HepG2細(xì)胞對(duì)比，有34條基因表達(dá)發(fā)生變化，19條基因變化是欖香烯特異的，如肝特異轉(zhuǎn)錄因子HNF-6轉(zhuǎn)錄增加，肝再生因子（LRF）的基因表達(dá)下降，細(xì)胞周期調(diào)控因子CDC25Hu2的基因表達(dá)降低，凋亡相關(guān)分子BBC3、TRIP 的基因表達(dá)下降等，采用RT-PCR 方法 驗(yàn)證了BBC3和TRIP基因的變化6。本實(shí)驗(yàn)在上述研究工作的基礎(chǔ)上研究了欖香烯聯(lián)合生物大分子合成的抑制劑對(duì)Hca-F的增殖、存活

17、、凋亡、細(xì)胞周期及形態(tài)學(xué)改變的影響。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用三種生物大分子合成抑制劑都不能阻斷欖香烯的抗瘤作用。THP可嵌入DNA雙鏈中，抑制DNA聚合酶的活性，從而抑制DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。拓?fù)涮婵的軌蛞种仆負(fù)洚悩?gòu)酶，從而抑制DNA復(fù)制。兩藥都不能阻斷欖香烯的抗瘤作用。放線菌酮是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的抑制劑，能特異阻斷蛋白質(zhì)的合成，許多實(shí)驗(yàn)常用放線菌酮預(yù)處理觀察藥物作用及細(xì)胞代謝、功能、凋亡等過(guò)程對(duì)新的蛋白質(zhì)生物合成的依賴性7。放線菌酮預(yù)處理并不能阻斷欖香烯對(duì)Hca-F細(xì)胞增殖的抑制作用，表明欖香烯抗腫瘤作用對(duì)新的蛋白質(zhì)表達(dá)依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯作用于腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)

18、胞中的某些蛋白質(zhì)（如酶）等直接殺傷腫瘤靶細(xì)胞。由于欖香烯分子小，抗癌作用比較獨(dú)特，尤其是不與其他抗癌藥有交叉耐藥性，與其他抗癌藥聯(lián)合 應(yīng)用 是值得探討的 問(wèn)題 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯和拓?fù)涮婵怠HP合用可使其抗癌作用增強(qiáng)，這對(duì)欖香烯聯(lián)合其他藥物治療腫瘤可能有一定 參考 意義?！緟⒖?文獻(xiàn) 】1 時(shí)繼慧. 溫莪術(shù)揮發(fā)油的實(shí)驗(yàn)研究欖香烯抗腫瘤作用的研究.中藥通報(bào)，1981，6：32.2 凌茂英. 小鼠肝癌（Hca）兩株克隆細(xì)胞系轉(zhuǎn)移表型的比較.大連醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1994，16：124-129.3 金梅.欖香烯對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其瘤苗免疫效應(yīng)的研究. 中國(guó) 腫瘤生物治療雜志，1999，6：219-222.4 錢振超，劉金友，趙肅榮，等.莪術(shù)瘤苗的主動(dòng)免疫保護(hù)效應(yīng)莪術(shù)抗瘤原理的探討.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1981，16：892-899.5 錢振超，王大慶，金成鋼，等.瘤苗特異主動(dòng)免疫治療及