敏感期內(nèi)、末單眼斜視和剝奪貓視覺系統(tǒng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達機理研究

1、    敏感期內(nèi)、末單眼斜視和剝奪貓視覺系統(tǒng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達機理研究邵立功郭靜秋 摘要目的觀察和研究敏感期內(nèi)、末不同時限單眼斜視(monocular strabismus，MS)和單眼剝奪(monocular deprivation，MD)幼貓視皮質(zhì)、外側(cè)膝狀體的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的可塑性變化。從形態(tài)學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)角度探討不同時限MS和MD幼貓視覺系統(tǒng)神經(jīng)元可塑性變化機理。方法以免疫細胞化學(xué)(streptavidin biotinperoxidae complex,

2、SABC)技術(shù)染色和計算機圖像分析方法檢測了BDNF在正常和敏感期內(nèi)、末MS和MD組幼貓同側(cè)視皮質(zhì)、外側(cè)膝狀體的變化規(guī)律，數(shù)據(jù)行t檢驗處理。結(jié)果在視皮質(zhì)，光鏡下BDNF免疫細胞化學(xué)染色呈棕褐色，錐體細胞具有較清晰的突觸錐形特征。在MS1和MD1組幼貓的視皮質(zhì)17區(qū)IV層BDNF免疫陽性反應(yīng)及陽性神經(jīng)元顯著減少，與正常組比較具有非常顯著差異性(P0.01，P0.001)，MS2和MD2組與正常組比較無差異性(P>0.05)。在外側(cè)膝狀體，光鏡下可見正常組眼輸入的A、A1和C層三層中均有BDNF免疫陽性反應(yīng)和陽性神經(jīng)元存在，并且以A和A1層染色較濃。大、小細胞均著色，在MS1和MD1組幼貓實

3、驗眼輸入的外側(cè)膝狀體相應(yīng)層BDNF表達的免疫陽性反應(yīng)深度及陽性神經(jīng)元數(shù)密度減少，與正常組幼貓眼輸入的外側(cè)膝狀體相應(yīng)層比較具有非常顯著性差異(P0.01)，而MS2和MD2組與正常組比較則無差異性(P>0.05)。結(jié)論BDNF對敏感期內(nèi)所致斜視和剝奪更為敏感，可能原因為BDNFmRNA的表達受視覺信息輸入，或受視網(wǎng)膜活性調(diào)節(jié)，它參與神經(jīng)環(huán)路的形成和突觸的活性修飾，并在外側(cè)膝狀體形成與視皮質(zhì)特殊連接過程中及視覺信息輸入活性依賴的調(diào)節(jié)上起著更為重要作用。 關(guān)鍵詞斜視剝奪腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子敏感期 Studies on mechanism of gene expression of BDNF in

4、 the visual system of kittens within and the end of crucial periods SHAO Li GongGUO Jing Qiu From theDepartment of Ophthalmology,the General Hospital of People's Liberation Army,Beijing 100853,China Abstract Objective and Methods To investigate the changes and distribution of gene expression of

5、BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)in the visual system of the experimental groups with immunocytochemistry SABC technique and computer image Analysis method.changes in number density and IOD(immunopositive concentration)of immunopositive neurons of gene expression of BDNF in the layer IV of vis

6、ual cortex area 17 and the laminas of lateral geniculate nucl us inputs from N,MS1,MD1,MS2 and MD2 eyes were analysed by Computer Image Analysis System.Results Showed that there are immunopositive neurons which appear as brown colour in the layer , / ， ， V and VI of visual cortex area 17 and the lam

7、inas of lateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes BDNF protein of immunopositive cellular number and concentration in the layer IV of visual cortex area 17 and the laminas oflateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes are the most in N group and the lowest in MS1

8、and MD1 troups.However,N/MS2 and N/MD2 by comparison have not a significant difference.Conclusion BDNF may make an important role in differentiation,development and forming of synapses united each other of visual system.The studies indicated that changes in gene expression and function of BDNF mRNA

9、are affected by visual exp rience.So,visual disturbance and form deprivation may lead to reduction for gene expression of BDNF protein.Therefore,biological function and activity of BDNF may be based on whether inputs from visual information of retina and experimental eyes of retinal activity are nor

10、mal or not. Key words strabismus;deprivation;brain derived neurotrophic factor period;crucial 兒童弱視主要是在小兒視覺發(fā)育敏感期內(nèi)，由于各種影響視覺發(fā)育的眼病和/或視環(huán)境的不良，使雙眼視長期紊亂、視覺系統(tǒng)神經(jīng)元功能、形態(tài)和神經(jīng)生化機制異常，臨床表現(xiàn)有外眼及眼底檢查無特殊變化，又不能完全矯正其低視力(0.8)、失立體視和形覺障礙等體征1。由此可知，單眼斜視(monocular strabismus, MS)和單眼剝奪(monocular deprivation, MD)對嬰幼兒童的危害不僅在于影響單眼視

11、力，并且若不在敏感期內(nèi)及時治療病人，則由患眼輸入的視覺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的塑性變化，形成立體視盲，這會使得患病兒童將來參加社會工作和擇業(yè)受到嚴重影響。弱視動物模型基礎(chǔ)研究可為小兒眼科臨床弱視防治工作提供參考依據(jù)，并較客觀地反映了人類弱視形成的特點，具有指導(dǎo)意義。因此，弱視發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究變得更為重要，它是臨床眼科防治弱視亟待解決的關(guān)鍵問題。基于這一觀點，本項研究擬應(yīng)用組織學(xué)、免疫細胞化學(xué)技術(shù)對弱視動物模型的視皮質(zhì)、外側(cè)膝狀體的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的變化進行觀察研究。從形態(tài)學(xué)、分子神經(jīng)生物學(xué)角度研究探討不同時限M

12、S和MD動物模型視覺系統(tǒng)三級神經(jīng)元及其突觸可塑性變化的神經(jīng)生物機理。 1材料與方法 1.1實驗動物和試劑本實驗采用實驗用純種虎皮貓共計32只。其中46wk齡幼貓24只，1012wk齡幼貓8只。動物隨機分為5組：(1)正常組(normalgroup,N)；(2)單眼斜視組(monocular strabismus1,MS1)；(3)單眼剝奪組(monocular deprivation1,MD1)。上述3組每組8只為46wk齡，共計24只；(4)單眼斜視組(MS2)；(5)單眼剝奪組(MD2)。上述兩組每組4只為1012wk齡，共計8只。實驗試劑：(1)常用試劑：為市售純化學(xué)分析試劑，由中國軍事

13、醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。(2)主要試劑：SABC(streptavidin biotinperoxidae complex)博士德生物工程公司，正常羊血清和BDNF抗體購自中山公司。儀器：振動切片機、CQ970型計算機圖像分析儀、Nikon雙目自動照像顯微鏡、腦立體定位儀、石蠟切片機。 1.2實驗方法 1.2.1單眼斜視和剝奪性弱視動物模型手術(shù)制做和飼養(yǎng)單眼斜視組(MS)動物模型手術(shù)制作：在微量噻胺酮(compound ketamine)0.1mL . kg1肌注麻醉下，結(jié)膜下注射少量利多卡因(5g . L1)，沿角膜緣2mm處剪開球結(jié)膜并分離找出一眼外直肌切除，然后再徹底分離周圍結(jié)締組

14、織及外側(cè)韌帶，術(shù)后實驗眼形成內(nèi)斜視。手術(shù)眼別分別為右眼6只，左眼6只。其中8只眼為46wk幼貓(MS1)，4只眼為1012wk貓(MS2)。 單眼剝奪組(MD)幼貓為剪除眼瞼緣周圍毛發(fā)后，自內(nèi)眥到外眥剪除上下瞼緣各11.5mm，皮下及皮膚分層縫合封閉實驗眼。MD眼別：右眼6只，左眼6只。敏感期內(nèi)(46wk)8只眼(MD1)，敏感期末4只眼(1012wk,MD2)。動物的飼養(yǎng)環(huán)境是在寬敞飼養(yǎng)室內(nèi)。N和MS1，MD1，MS2及MD2組實驗貓共同在自然光線環(huán)境中散放喂養(yǎng)。 1.2.2實驗動物的灌注固定和取材實驗動物在飼養(yǎng)到第16周時，進行MPCEPs檢測，電生理實驗后分批灌注固定實驗貓并快速取材。(

15、1)動物麻醉后行開胸并剪開心包膜，右心室切開放出心血管系統(tǒng)血液，快速切開左心室并經(jīng)左心室主動脈插管灌注生理鹽水500mL沖洗心血管系統(tǒng)，接快灌注4冷固定液(4g . L1多聚甲醛磷酸緩沖液，pH7.2)，再慢灌注1000mL含4g . L1多聚甲醛，5g . L1戊二醛和2g . L1苦味酸的4磷酸緩沖溶液(pH7.2)2h。在4冰箱放置過夜后，標本塊轉(zhuǎn)至150g . L1蔗糖溶液(PBSpH7.2)中浸泡12h，待標本塊下沉后行振動切片;(2)標本取材順序為：開顱取腦垂直腦矢狀軸切取視皮質(zhì)組塊，部分切片為平行視皮質(zhì)17區(qū)切取免疫組織化學(xué)染色后選取IV層組織切片。冠狀切取同側(cè)和對側(cè)外側(cè)膝狀體組

16、織。(3)振動切片，組織片厚3540m;(4)免疫細胞化學(xué)SABC技術(shù)處理切片：切片入PBS緩沖溶液(0.1mol/L，pH7.2)漂洗;用甲醇加3g . L1H2O2處理切片1530min(室溫)封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性;2g . L1TritonX100液中10min(室溫);以正常羊血清孵育1525min(室溫)，以封閉組織中的非特異性抗原;滴加兔抗人第一抗體(1500)BDNF抗體，濕盒內(nèi)孵育1.5h(室溫)然后在4冰箱過夜;PBS緩沖液充分沖洗，以去除切片上非特異吸附抗體;再經(jīng)3g . L1TritonX100/PBs漂洗2min后，依次加入生物素標記的羊抗兔1gG(1200)和SA

17、BC復(fù)合物(1100)中孵育30min(室溫);PBS緩沖液漂洗;用DABH2O2液顯色。試劑組成為DAB50mg，0.05M的TB100mL，300g . L1H2O23040L;將呈色后的組織切片置于流水中，以便終止呈色反應(yīng);11酒精梯度脫水，HemoDe透明，DPX封固;12光鏡下觀察計算機圖像分析。 1.2.3計算機圖像分析免疫細胞化學(xué)(1)免疫細胞化學(xué)結(jié)果分析程序：參照細胞構(gòu)筑學(xué)特點，將N.MS1.MD1，MS2和MD2組內(nèi)每只幼貓同側(cè)視皮質(zhì)和外側(cè)膝狀體組織連續(xù)切片各5張，在QTM970型圖像分析儀的10×40倍光鏡視野下，測量其BDNF蛋白在上述解剖部位表達的單位面積內(nèi)的

18、積分光密度(IOD/Area)及數(shù)密度(Numberical Density)，數(shù)密度用：免疫陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)面積表示。每張切片選取5個視野。(2)統(tǒng)計學(xué)分析處理：所有數(shù)值均以均數(shù)±標準差(x±s)表示。應(yīng)用美國SAS公司SAS6.04版PC統(tǒng)計軟件包在P586/133Hz計算機上進行t檢驗處理。 2結(jié)果 BDNF與NGF及NT3同屬NGF家族具有同源性及相互交叉的分子生物學(xué)特性3，4。BDNF與NGF及NT3的不同點是它的分布廣，BDNF免疫陽性反應(yīng)遍及視皮質(zhì)全層及外側(cè)膝狀體A、A1和C層。在視皮質(zhì)，光鏡下BDNF免疫組織化學(xué)染色表征呈棕褐色，神經(jīng)元軸樹突觸不明顯，但在

19、錐體細胞則具有較清晰的突觸錐形特征。在MS1和MD1組幼貓的視皮質(zhì)17區(qū)IV層BDNF免疫陽性反應(yīng)及陽性神經(jīng)元顯著減少，與N組比較具有非常顯著差異性(P0.01，P0.001)，而MS2和MD2組與N組比較無差異性(P0.05)。在外側(cè)膝狀體，光鏡下可見N組幼貓正常眼輸入的A、A1和C層3層中均有BDNF免疫陽性反應(yīng)和BDNF免疫陽性神經(jīng)元存在，并且以A和A1層免疫染色更濃，大、小細胞均著色，而C層染色較淡，免疫陽性細胞少，這可能是由于視束到達外側(cè)膝狀體的終末所致。在MS1和MD1組幼貓實驗眼輸入的外鍘膝狀體相應(yīng)層BDNF表達產(chǎn)物的免疫陽性反應(yīng)深度及免疫陽性神經(jīng)元數(shù)密度減少，與N組幼貓外側(cè)膝狀

20、體相應(yīng)層比較具有非常顯著性差異(P0.01)，MS2和MD2組與N組比較無差異性(P>0.05)。 本實驗結(jié)果顯示了BDNF對敏感期內(nèi)所致斜視和剝奪更為敏感，其可能原因為BDNFmRNA的表達受視覺信息輸入或受視網(wǎng)膜活性調(diào)節(jié)。 3討論 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期具有高表達特征。BDNF有使CNS(中樞神經(jīng)系統(tǒng))神經(jīng)元分化、增殖及成熟的作用，并且BDNF與NGF和NT3通過高親和力受體有交互作用5，6。本實驗結(jié)果敏感期內(nèi)所致的單眼斜視和剝奪幼貓其視覺系統(tǒng)三級神經(jīng)元的BDNF免疫陽反應(yīng)濃度和免疫陽性

21、細胞數(shù)密度與正常對照組比顯著下降，與Schoups等7實驗結(jié)果相符。Schoups等發(fā)現(xiàn)經(jīng)黑暗處置或通過注射河豚魚毒素(TTX)阻滯視網(wǎng)膜輸入至視皮質(zhì)過程可使BDNFmRNA表達降到50。而敏感期內(nèi)單眼剝奪也可使視皮質(zhì)BDNFmRNA表達顯著減少8。在CNS正常情況下，BDNF可達每克腦組織含110mg . g1腦組織，BDNF和它的受體trkB廣泛地存在于視覺神經(jīng)系統(tǒng)，其活性主要依賴視網(wǎng)膜的功能是否正常，即由視信息的輸入調(diào)節(jié)，實驗證明在黑暗中處置的鼠在曝光后可引起視皮質(zhì)的BDNFmRNA表達變化9。 本實驗在正常組幼貓可見BDNF反應(yīng)細胞呈現(xiàn)于整個視路，可以認定BDNF參與視覺系統(tǒng)的全部發(fā)育

22、過程。BDNF在視皮質(zhì)的表達出現(xiàn)于/、V和VI層，本實驗敏感期末單眼斜視及剝奪組貓視覺系統(tǒng)三級神經(jīng)元及突觸的BDNF免疫陽性反應(yīng)濃度及免疫陽性細胞數(shù)密度與正常對照組比較未見顯著性變化(P>0.05)，可見BDNF在敏感期末所受影響甚小。 Hallbook等10認為BDNF在視覺系統(tǒng)的表達，其基礎(chǔ)水平受視網(wǎng)膜活性的調(diào)制。BDNF在視皮質(zhì)的免疫反應(yīng)分布，各家報導(dǎo)不一。有人認為BDNF蛋白主要存在于錐體細胞集中的V層。BDNF對視皮質(zhì)的塑性效應(yīng)具有重要意義，BDNF參與并影響視皮質(zhì)的發(fā)育及外側(cè)膝狀體神經(jīng)元軸突的分離。在發(fā)育中BDNF可能是完成LGN神經(jīng)元突觸發(fā)育的重要因子11。BDNF和其受體

23、trkB出現(xiàn)在視皮質(zhì)水平主要存在于錐體細胞和GABA能神經(jīng)元，有些谷氨酸能神經(jīng)元也有BDNF和trkB的復(fù)合表達12，BDNF在錐體細胞的表達可調(diào)制GABA能神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的產(chǎn)生。BDNF對單眼剝奪動物視皮質(zhì)眼優(yōu)勢柱可塑性變化的顯著效應(yīng)是由于它直接作用于視皮質(zhì)神經(jīng)元，BDNF可調(diào)節(jié)突觸后的GABA、Glu和Ach的釋放13。在單眼剝奪幼貓，外源性提供BDNF可以引起眼優(yōu)勢漂移向剝奪眼，在視皮質(zhì)注入GABA拮抗劑則可再生產(chǎn)眼優(yōu)勢向?qū)?cè)眼的逆轉(zhuǎn)14。以本實驗結(jié)果看，BDNF對敏感期內(nèi)動物視覺系統(tǒng)的發(fā)育有著重要作用。外源提供BDNF可拮抗視覺發(fā)育敏感期內(nèi)的斜視和剝奪效應(yīng)，同理視環(huán)境的紊亂也制

24、約著內(nèi)源性BDNF的表達及其受體trkB的活性及數(shù)量變化。如果在視覺發(fā)育的敏感期內(nèi)，早期人為外源提供BDNF并矯正視環(huán)境系系亂(如矯正斜視及剝奪)有希望可逆轉(zhuǎn)其斜視和剝奪所產(chǎn)生的弱視效應(yīng)。 作者單位：100853北京，中國人民解放軍總醫(yī)院眼科(邵立功)；北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院小兒眼科(郭靜秋) 參考文獻： 1邵立功.弱視貓視皮質(zhì)17區(qū)神經(jīng)元cfos基因表達特性的研究.中華眼科雜志1993;29(6)：366369. 2郭靜秋.全國小兒眼科新進展會議匯編資料(講演報告).1993年10月. 3Rodriguez TA,Dechant G, Barde YA.Binding of brain der

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