聚谷氨酸高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化.

1、聚谷氨酸高產(chǎn)葡抹能選及發(fā)哮條件優(yōu)化中國(guó)生物工程雜志 China Biotechnology, 2005, 25（12）:6265胡榮章1葉海峰1金麗1吳昌琳2吳自榮1*（1華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院上海2000622華東師范大學(xué)物理系上海200062）摘要Y -報(bào)道了以11株枯草芽孢桿菌菌株為培養(yǎng)菌株，用3種谷氨酸鈉含量不同的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選獲得1株丫:初始pH、接種量、通氣量等發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為： 250ml三角燒瓶裝液40ml,接種體積分?jǐn)?shù) 5%,麥芽糖50g/L ,酵母膏10g/L ,谷氨酸鈉30g/L , NaCl 10g/L ,KH2PO4 5g/L, MgSO4

2、 7H2O 0.5g/L，初始pH6.0，發(fā)酵60h，此時(shí)丫聚睿気皎產(chǎn)呈収達(dá)到30.26g/L，比國(guó)外報(bào)道的20g/L的產(chǎn)量有顯著提高。純化后產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜及核磁共 振檢測(cè)，鑒定為丫熱關(guān)鍵詞聚谷氨酸芽孢桿菌篩選發(fā)酵條件優(yōu)化收稿日期：20050628修回日期：20051008* 通訊作者，電子信箱：zrwu 丫 影打気酸 L 丫 polyglutamic acid,Y PGA是由微生物合成的一種細(xì)胞外高分子量聚合物，由谷氨酸的a 氨基和丫 鞍基縮合而成。Shih等1 首次發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的莢膜中含有丫 PGA隨后發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌屬細(xì)菌能夠通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)積累丫 PGAY PGA分子鏈上具有較高活性的

3、羧基（-COOH,可與一些藥物結(jié)合生成較穩(wěn)定的復(fù)合物，在體內(nèi)可被溶酶體降解為內(nèi)源性谷氨酸，并釋放出藥物，是一種理想的藥物載體2,3 。此外，它還具有水溶性、可生物降解、可食用、吸水性強(qiáng)、對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒害作用等特性，因而被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、水處理、農(nóng)業(yè)醫(yī)藥等方面4。但由于微生物發(fā)酵產(chǎn)量低， 生產(chǎn)成本過(guò)高，因此還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，故篩選高產(chǎn)菌種、降低生產(chǎn)成本是解決問(wèn)題的 關(guān)鍵。本研究從篩選高產(chǎn)菌種、優(yōu)化發(fā)酵條件、提高產(chǎn)量著手進(jìn)行了初步探討。1材料和方法1.1材料1.1.1菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus. sp ）共11株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B

4、培篩選培養(yǎng)基：培養(yǎng)基 A、 培養(yǎng)基養(yǎng)基1.1.3主要試劑丫PGA標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，酵母膏、蛋白胨、麥芽糖進(jìn)口分裝，谷氨酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1發(fā)酵方法菌種活化：取菌種一環(huán)，接入斜面培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)11h，用作活化菌種。種子培養(yǎng)：將1ml凍存菌種接入種子培養(yǎng)基，37C、210r/min，震蕩培養(yǎng)11h。發(fā)酵培養(yǎng)：按5%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基（250ml瓶裝液50ml） 37C、220r/min，震蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)yPGA產(chǎn)量。1.2.2分析方法細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定：發(fā)酵液稀釋25倍，721分光光度計(jì)測(cè)其660nm處光吸收A660。Y PGA測(cè)定：發(fā)酵液用蒸餾水稀釋4倍，

5、12000r/min、15min離心去菌體，上清液加入3倍體積冰無(wú)水乙醇，攪拌得沉淀，干燥得粗品6，稱重（每項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次）。丫 PGA純化：用蒸餾水溶解粗品，對(duì)蒸餾水反復(fù)透析，透析液冷凍干燥得純品。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征分析：采用Nexus 670傅立葉紅外光譜儀測(cè)定 丫PGA標(biāo)準(zhǔn)品及自制的丫PGA樣品7上采用AVANCE 500MHZ核磁共振儀測(cè)定自制的丫PGA樣品8。13CNMF以 D20為溶劑，1HNMR以 H20為溶劑。2結(jié)果與討論2.1 丫PGA高產(chǎn)菌篩選丫PGA生產(chǎn)菌分為兩類，一類是谷氨酸非依賴型，如：B. subtilis TAM4，B.licheniformis A35等1 。另一類是

6、谷氨酸依賴型9,而谷氨酸依賴型又可分為兩小類，一類需大量谷氨酸才能合成丫 PGA 女口： B. licheniformisATCC9945A, B. subtilis F021等】1;另一類只需少量谷氨酸就能合成丫PGA（谷氨酸起誘導(dǎo)作用如：B.subtilisIFO 3335） : 1。因此分別選用谷氨酸鈉含量不同的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基A,B,C ）來(lái)篩選高產(chǎn)菌。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)用菌在培養(yǎng)基 C （無(wú)谷氨酸鈉）中均不合成丫 PGA而在培養(yǎng)基B （谷 氨酸鈉20g/L ）中，只有菌株1#、2 #、5#、11#能合成丫 PGA但產(chǎn)量不高；在培養(yǎng) 基A （谷氨酸鈉70g/L ）中共7株菌能合成丫 PG

7、A而1#菌在培養(yǎng)基 A和B中產(chǎn)量均為最 高。故選1#菌株作為發(fā)酵條件優(yōu)化菌株。2005, 25（12）胡榮章 等：丫女中國(guó)生物工程雜志 Ch ina Biotech nology Vol.25 No.12 200522 丫PGA發(fā)酵條件優(yōu)化2.2.1營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)丫PGA合成的影響（1）碳源篩選及其濃度優(yōu)化發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基除碳源外其他條件完全相同，分別添加30g/L的麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘油作為碳源。結(jié)果（圖1）表明以麥芽糖作碳源時(shí)， 丫 PGA產(chǎn)量最高，故選麥芽糖作碳源。圖1不同碳源對(duì)丫PGA產(chǎn)量的影響Fig.1Effect of various carb on sources onyPGA p

8、roductio n圖2麥芽糖濃度對(duì)丫PGA產(chǎn)量的影響Fig.2Effect of the concen trati on of maltose on丫PGA productio n以發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)， 選擇不同濃度麥芽糖來(lái)考察其對(duì) 丫 PGA產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖 2,可看出在1050g/L范圍內(nèi)，丫 PGA產(chǎn)量隨著麥芽糖濃度增加而顯著提高。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，麥芽糖最佳濃度選 50g/L。（2）氮源篩選及其濃度優(yōu)化發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基除氮源外其他條件完全相同，分別以5g/L的牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、酵母膏為氮源。結(jié)果見(jiàn)圖3,最終選擇酵母膏作發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。圖3不同氮源對(duì)丫PGA產(chǎn)量的影響Fig.

9、3Effect of various n itroge n sources on丫PGA productio n圖4酵母膏濃度對(duì)丫PGA產(chǎn)量的影響Fig.4Effect of the concen trati on of yeast on丫PGA productio n以發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，酵母膏濃度分別選2、5、8、10、12和15g/L來(lái)考察最適濃度。結(jié)果如圖4,最終選定酵母膏濃度為10g/L。（3）谷氨酸鈉濃度優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)用菌是谷氨酸依賴型，谷氨酸是丫PGA合成原料，所以得考察谷氨酸鈉對(duì)丫PGA產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鈉濃度對(duì)丫PGA產(chǎn)量影響較大，在3050g/L時(shí)較適宜，最終選擇谷

10、氨酸鈉濃度30g/L。（4）培養(yǎng)基組分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合單因素試驗(yàn)，選取麥芽糖、酵母膏、谷氨酸鈉為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)了 3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1The desig n of orthogo nal testand results of an alysis因素123麥芽糖g/L (A)10510酵母膏g/L (B)501030谷氨酸鈉g/L (C)901550實(shí)驗(yàn)號(hào) ABCy PGA (g/L)11112.622122 3.9231333.64421220.54522317.26 2318.52731313.4683212.2293 32

11、25.78k13.39312.2074.453k215.4207.78016.747k313.82012.67411.433R12.0274.86712.294由表1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中級(jí)差分析可看出谷氨酸鈉用量對(duì)丫PGA產(chǎn)量影響最大，麥芽糖用量次之，適當(dāng)提高二者用量可增加產(chǎn)量；而酵母膏對(duì) 丫PGA產(chǎn)量的影響并不顯著。2.2.2培養(yǎng)條件對(duì)丫PGA合成的影響(1) 通氣量對(duì)丫PGA合成的影響裝液量的不同會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中溶解氧含量的不同，這對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成會(huì)造成影響。在研究了裝液量分別為20、30、40、50、60和70ml時(shí)，發(fā)現(xiàn)裝液量為40ml時(shí)丫 PGA產(chǎn)量最高；但溶解氧含量并非越高越好，裝液量

12、低于40ml時(shí)，產(chǎn)量同樣較低，可能溶解氧過(guò)高改變了某些代謝途徑而引起產(chǎn)量下降。(2) 初始pHpH主要影響酶活、菌對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而影響產(chǎn)物合成。實(shí)驗(yàn)研究了 pH分別在5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9時(shí)對(duì)產(chǎn)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH在6.0時(shí)產(chǎn)量最高。接種量對(duì)丫PGA合成的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種量對(duì)丫PGA產(chǎn)量影響較大，接種量過(guò)大(7%, 9%)或過(guò)小(3%均對(duì)丫PGA合成不利，當(dāng)接種量在5%時(shí)，產(chǎn)量最高。 發(fā)酵時(shí)間對(duì)丫PGA合成的影響考察了發(fā)酵時(shí)間分別為12、24、36、48、60和72h對(duì)丫PGA合成的影響。結(jié)果表明，丫PGA產(chǎn)量在60h達(dá)最高。生長(zhǎng)曲線

13、表明丫PGA積累主要在平臺(tái)期，說(shuō)明此時(shí)菌體能量不再用來(lái)大量繁殖，主要消耗在產(chǎn)物合成上。2.3樣品結(jié)構(gòu)分析2.3.1紅外光譜用Sigma公司丫PGA標(biāo)準(zhǔn)品及自制純化后的 丫PGA羊品作紅外譜圖檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者所有特征峰均相吻合(圖未給出)。表明發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)品一致，即為丫 PGA2.3.2核磁共振譜圖本研究制備純化后的丫PGA樣品通過(guò)1HNMR和13CNMF鑒定，結(jié)果如圖5、6所示，各譜峰歸屬見(jiàn)圖上標(biāo)注，結(jié)合氫譜、碳譜分析可斷定發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式 為 NH- CHCOOHCH2- CH2- CO 勺丫PGA理 論結(jié)構(gòu)一致。圖5樣品的1HNMRt圖Fig.51H spectra of 丫 PGA s

14、ample圖6樣品的13CNMRt圖Fig.613C spectra of 丫 PGA sample3結(jié)論通過(guò)以上研究我們篩選到了一株丫PGA高產(chǎn)菌，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)條件及培養(yǎng)條件均對(duì)其產(chǎn)量有較大影響，本實(shí)驗(yàn)用菌最佳發(fā)酵條件為：250ml三角燒瓶裝液40ml，接種體積分 數(shù)為 5%,麥芽糖 50 g/L，酵母膏 10g/L，谷氨酸鈉 30 g/L , NaCl 10g/L , KH2PO4 5g/L, MgSO4 7H2O0.5g/L，初始pH6.0，發(fā)酵60h。此時(shí)丫PGA產(chǎn)量可達(dá)30.26g/L，這比國(guó)外Ito等10報(bào)道的發(fā)酵96h, 20g/L的產(chǎn)量有顯著提高。本研究結(jié)果為丫PGA規(guī)?；l(fā)

15、酵生產(chǎn)提供了有意義的基礎(chǔ)參數(shù)。參考文獻(xiàn)1 Shih I L, Van Y T. The production of poly( 丫 glutamic acid) frommicroorga ni smsand itsvariousapplicati ons.BioresourceTech nology,2001,79(3):207225:2 :陳國(guó)廣，陳茂偉，韋萍，等.聚谷氨酸及其衍生物在新型藥物傳輸系統(tǒng)中的應(yīng)用南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,25(2):7577Che n G G, Che n M W, Wei P, et al. Journal of Nanji ng Un iversity

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20、itions of Bacillus Strainwith High productive Poly 丫 glutamic acidHU Rong zha nglYE Hai fen glJIN LilWU Cha nglin 2WU Zi rongl(1 School of Life Scienee, East China Normal UniversityShanghai200062, China) (2 Physics Departme nt, East Chi na Normal Uni versitySha nghai200062, Chi na)AbstractPoly 丫 glu

21、tamic acid is a biodigested high molecular material which can be used in many ways. A highproductive poly 丫 glutamic acid strainfrom 11 Bacillus stra ins was scree ned by culturi ng in three differe nt mediums. In order to enhance the product ion of this stra in, we optimized the ferme ntatio n con diti ons, such as carb on source,n itroge nsource,concen trati onof sodiumglutamate, initial pH, inoculation