熒光光譜分析

1、第九章第九章 分子熒光光譜法分子熒光光譜法Molecular fluorescence spectroscopy 光致發(fā)光和分子熒光光譜法光致發(fā)光和分子熒光光譜法9.1 熒光光譜法基本原理熒光光譜法基本原理 9.2 熒光分析儀器和熒光法的應(yīng)用熒光分析儀器和熒光法的應(yīng)用光致發(fā)光（光致發(fā)光（Photoluminescence）: 熒光和磷光是分子吸光熒光和磷光是分子吸光成為激發(fā)態(tài)分子，在返回基態(tài)時(shí)的發(fā)光現(xiàn)象，稱為光致發(fā)光。成為激發(fā)態(tài)分子，在返回基態(tài)時(shí)的發(fā)光現(xiàn)象，稱為光致發(fā)光。特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高。檢測(cè)限比吸收光譜法低靈敏度高。檢測(cè)限比吸收光譜法低13個(gè)數(shù)量級(jí)；個(gè)數(shù)量級(jí)；線性范圍寬；線性范圍寬；選擇

2、性比吸收光譜法好。因?yàn)槟墚a(chǎn)生紫外可見吸收的分子不選擇性比吸收光譜法好。因?yàn)槟墚a(chǎn)生紫外可見吸收的分子不一定發(fā)射熒光或磷光；一定發(fā)射熒光或磷光；應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光。應(yīng)用范圍不如吸收光譜法廣，因?yàn)橛械姆肿硬话l(fā)熒光?；诨衔锏臒晒鉁y(cè)量而建立起來的分析方法稱為基于化合物的熒光測(cè)量而建立起來的分析方法稱為分子熒光光分子熒光光譜法。譜法。9.1 9.1 熒光光譜法基本原理熒光光譜法基本原理 9.1.1 9.1.1 分子的激發(fā)與失活分子的激發(fā)與失活1. 1. 分子的多重態(tài)分子的多重態(tài)單重態(tài)單重態(tài) 一個(gè)所有電子自旋都配對(duì)一個(gè)所有電子自旋都配對(duì)的分子的電子狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)的分子的電子

3、狀態(tài)。大多數(shù)有機(jī)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)物分子的基態(tài)是單重態(tài)。當(dāng)基態(tài)一對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高一對(duì)電子中的一個(gè)被激發(fā)到較高能級(jí)，其自旋方向不會(huì)立刻改變，能級(jí)，其自旋方向不會(huì)立刻改變，分子仍處于單重態(tài)。分子仍處于單重態(tài)。三重態(tài)三重態(tài) 有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。較激發(fā)單重態(tài)低。2. 2. 激發(fā)態(tài)分子的失活激發(fā)態(tài)分子的失活: : 激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，它要以輻射激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，它要以輻射或無輻射躍遷的方式回到基態(tài)。或無輻射躍遷的方式回到基態(tài)。無輻射躍遷無輻射躍遷振動(dòng)弛豫：振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中

4、的較高振動(dòng)能級(jí)激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級(jí)中的較高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過程，其效率較高。轉(zhuǎn)至較低振動(dòng)能級(jí)的過程，其效率較高。 內(nèi)轉(zhuǎn)換：內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級(jí)間，電子由高能級(jí)回相同多重態(tài)的兩個(gè)電子能級(jí)間，電子由高能級(jí)回到低能級(jí)的分子內(nèi)過程。到低能級(jí)的分子內(nèi)過程。 系間竄越：系間竄越： 激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。重態(tài)發(fā)生變化的過程。 外轉(zhuǎn)換：外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑與其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)激發(fā)態(tài)分子與溶劑與其他溶質(zhì)相互作用、能量轉(zhuǎn)換而使熒光換而使熒光 （或磷光）減弱甚至消失的過程。熒光強(qiáng)度的（或磷光）減弱甚至消

5、失的過程。熒光強(qiáng)度的減弱或消失，稱為熒光熄滅（或猝滅）減弱或消失，稱為熒光熄滅（或猝滅）。 輻射躍遷輻射躍遷:熒光：熒光：受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振受光激發(fā)的分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。壽命為10-8 10 -11s。由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，由于是相同多重態(tài)之間的躍遷，幾率較大，速度大，速率常數(shù)速率常數(shù)kf為為106109s-1。 磷光：磷光： 從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋多重態(tài)的所發(fā)出的輻射。由于磷光的產(chǎn)生伴隨自旋

6、多重態(tài)的改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，磷光壽命為改變，輻射速度遠(yuǎn)小于熒光，磷光壽命為10-4 10s。1. 1. 熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系F = KF = K（I I0 0I I）I I0 0入射光輻射功率；入射光輻射功率；I I透射光輻射功率；熒光透射光輻射功率；熒光量子產(chǎn)率（量子產(chǎn)率（）。）。 9.1.2 9.1.2 熒光強(qiáng)度及影響熒光的因素?zé)晒鈴?qiáng)度及影響熒光的因素?zé)晒馐俏镔|(zhì)吸收光子之后發(fā)出的輻射，熒光強(qiáng)度（熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的輻射，熒光強(qiáng)度（F F）與熒光物質(zhì)的吸光程度及其發(fā)射熒光的能力有關(guān)與熒光物質(zhì)的吸光程度及其發(fā)射熒光的能力有關(guān)。 bceII303. 20)1 (

7、303. 20bceIKFF = KF = K（I I0 0I I）根據(jù)朗伯根據(jù)朗伯-比爾定律，比爾定律，0lgII=bc則則假設(shè)假設(shè)bc0.05F = KI02.303 bc當(dāng)當(dāng)I0一定時(shí)一定時(shí) F = KC (K =KI02.303 b)即在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度即在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光法定量的基礎(chǔ)。成正比，這是熒光法定量的基礎(chǔ)。2. 2. 熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（）表示：）表示：吸收的光子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)激發(fā)態(tài)的分子數(shù)發(fā)射熒光的分子數(shù)iceciffkkkkk 凡

8、是使熒光速率常數(shù)凡是使熒光速率常數(shù)k kf f增大而使其他失活過程（系間竄越、增大而使其他失活過程（系間竄越、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素都可使熒光增強(qiáng)。外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素都可使熒光增強(qiáng)。與失活過程的速率常數(shù)與失活過程的速率常數(shù)k k有關(guān)：有關(guān)：熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系 （1 1）電子躍遷類型）電子躍遷類型 發(fā)射發(fā)射 *躍遷比躍遷比*n躍遷更常見躍遷更常見（2 2）共軛效應(yīng)）共軛效應(yīng) 芳香族化合物的熒光最常見且最強(qiáng)，大多芳香族化合物的熒光最常見且最強(qiáng)，大多數(shù)未取代芳烴在溶液中發(fā)熒光，隨著環(huán)的數(shù)目和稠合程數(shù)未取代芳烴在溶液中發(fā)熒光，隨著環(huán)的數(shù)目和稠合程度增加，熒

9、光峰紅移，度增加，熒光峰紅移，。簡(jiǎn)單雜環(huán)化合物不發(fā)熒光，。簡(jiǎn)單雜環(huán)化合物不發(fā)熒光，但具有稠環(huán)結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物都發(fā)熒光。但具有稠環(huán)結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物都發(fā)熒光。（3 3）平面剛性結(jié)構(gòu)效應(yīng)）平面剛性結(jié)構(gòu)效應(yīng) 有剛性結(jié)構(gòu)的分子容易發(fā)熒光，有剛性結(jié)構(gòu)的分子容易發(fā)熒光，剛性和共平面性的增加有利于熒光發(fā)射。剛性和共平面性的增加有利于熒光發(fā)射。CH2聯(lián)苯聯(lián)苯 =0.2 芴芴 =1 化合物化合物 相對(duì)熒光強(qiáng)度相對(duì)熒光強(qiáng)度 苯苯 10 10 C6H5COOHC6H5NO230C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020C6H5ClC6H5BrC6H5I750(4)(4)取

10、代基的影響取代基的影響芳環(huán)上有羧基、羰基或芳環(huán)上有羧基、羰基或亞硝基等亞硝基等吸電子基團(tuán)吸電子基團(tuán)取取代時(shí)，熒光減弱；代時(shí)，熒光減弱；給電子取代基給電子取代基如如-OH-OH、- -NHNH2 2、-CN-CN、-OCH-OCH3 3等會(huì)使等會(huì)使熒光強(qiáng)度增加。熒光強(qiáng)度增加。 重原子效應(yīng)重原子效應(yīng) 含有重原含有重原子的分子中，系間竄躍子的分子中，系間竄躍的幾率大的幾率大, ,使熒光減弱，使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。磷光增強(qiáng)。 熒光與環(huán)境因素的關(guān)系熒光與環(huán)境因素的關(guān)系溫度溫度降低會(huì)使熒光強(qiáng)度增大；降低會(huì)使熒光強(qiáng)度增大；帶有酸性或堿性取代基的芳香化帶有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與合物的熒光與pHp

11、H有關(guān)；有關(guān)；溶劑溶劑 溶劑極性增加有時(shí)會(huì)使熒溶劑極性增加有時(shí)會(huì)使熒光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)紅移；光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)紅移；若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會(huì)使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會(huì)使熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)改變；使熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)改變；含重原子的溶劑（碘乙烷、四含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱。溴化碳）使熒光減弱。溶解氧溶解氧的存在往往使熒光強(qiáng)度降的存在往往使熒光強(qiáng)度降低。低。化合物 相對(duì)熒光強(qiáng)度 C6H5OH 18 C6H5O 10C6H5NH2 20 +C6H5NH3 09.1.3 9.1.3 激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜 任何熒

12、光化合物都具有兩種特征任何熒光化合物都具有兩種特征光譜：光譜：熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）熒光激發(fā)光譜（吸收光譜）固定某一發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定該波固定某一發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定該波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)下的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化所得的光譜。變化所得的光譜。熒光發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光發(fā)射光譜（熒光光譜）固定某一激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定熒光固定某一激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定熒光發(fā)射強(qiáng)度隨發(fā)射波長(zhǎng)變化得到的發(fā)射強(qiáng)度隨發(fā)射波長(zhǎng)變化得到的光譜。光譜。熒光光譜的特點(diǎn)：熒光光譜的特點(diǎn)：斯托克斯位移（斯托克斯位移（Stokes shift)。與激發(fā)光譜相比，與激發(fā)光譜相比，熒光光譜的波長(zhǎng)總是出現(xiàn)在更長(zhǎng)的波長(zhǎng)處；熒光光譜的波長(zhǎng)總是出現(xiàn)在

13、更長(zhǎng)的波長(zhǎng)處；熒光光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。熒光光譜與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。無論用無論用=250和和350nm作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；作激發(fā)光源，所得熒光光譜形狀和峰的位置都是相同；吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對(duì)稱。吸收光譜與發(fā)射光譜大致成鏡像對(duì)稱。9.2 9.2 熒光分析儀器和熒光法的應(yīng)用熒光分析儀器和熒光法的應(yīng)用 9.2.1 9.2.1 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)既可用于定量分熒光分光光度計(jì)既可用于定量分析，也可用于測(cè)繪激發(fā)光譜和熒析，也可用于測(cè)繪激發(fā)光譜和熒光光譜。第一單色器選擇激發(fā)光光光譜。第一單色器選擇激發(fā)光波長(zhǎng)（波長(zhǎng)（250nm250nm的紫外光），故的紫

14、外光），故稱為激發(fā)單色器。第二單色器稱為激發(fā)單色器。第二單色器（熒光單色器）與激發(fā)光入射方（熒光單色器）與激發(fā)光入射方向垂直，并選擇熒光波長(zhǎng)，可提向垂直，并選擇熒光波長(zhǎng)，可提高方法的選擇性和準(zhǔn)確度。高方法的選擇性和準(zhǔn)確度。 9 9.2.2 .2.2 熒光法的應(yīng)用熒光法的應(yīng)用熒光法靈敏度高、選擇性好，可用于痕量分析，但是熒光法靈敏度高、選擇性好，可用于痕量分析，但是能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多，這是熒光法的應(yīng)用特點(diǎn)。能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多，這是熒光法的應(yīng)用特點(diǎn)。無機(jī)物通過與熒光試劑作用生成熒光螯合物而進(jìn)行熒無機(jī)物通過與熒光試劑作用生成熒光螯合物而進(jìn)行熒光分析，非過渡金屬離子的熒光螯合物較多，熒光試光分析，非過渡金屬離子的熒光螯合物較多，熒光試劑具有兩個(gè)（或以上）與劑具有兩個(gè)（或以上）與M MZ+Z+形成螯合物的電子給予體形成螯合物的電子給予體官